Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Różnicowanie megakariocytów
- Nasiona 5 × 105 komórek/ml komórek CD34 + w 2 ml SFM uzupełnionych 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (rhTPO) na studzienkę na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Jeśli komórki zlewają się, zanim będą potrzebne do analizy, zbierz komórki i podziel je na wiele dołków ze świeżą pożywką i rhTPO.
nuta: Dwa lub trzy dołki powinny być przygotowane specjalnie w celu monitorowania różnicowania w różnych punktach czasowych (np. dni 7, 9 i 10).
- Zbieraj komórki z odłożonych na bok studni w celu monitorowania różnicowania bez zakłócania komórek w innych studzienkach.
- Wybarwić komórki 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC i 10 μl przeciwciała anty-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 w końcowej objętości 100 μl. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiednich przeciwciał kontrolnych izotypu. Inkubować przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 - 300 μl SB. Przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.
- Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrole izotypu, aby ustawić bramkowanie dla populacji dodatnich FITC i Alexa Flour 647. Przeanalizuj barwione próbki komórek, aby określić procent podwójnie dodatnich komórek CD41 + / CD42a +, które reprezentują dojrzałe MK (Figura 1C).
- Do mikroskopowej wizualizacji markerów powierzchni komórek należy wybarwić komórki, jak opisano w ppkt 1.3.
- Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 μl SB i wirować na szkiełku podstawowym o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut. Zamocuj komórki na szkiełku, zanurzając je w metanolu na 30 s. Wysuszyć na powietrzu, dodać 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (patrz tabela materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (rysunek 2A).
- W celu wizualizacji antygenów wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić komórki w PBS i utrwalić paraformaldehydem (1% stężenie końcowe) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby przepuszczalność komórek należy dodać tryton-X 100 (0,1%) i inkubować przez 15 minut. Umyj komórki 2 ml PBS/0,1% triton-X 100. Zawiesić w 100 μl PBS/0,1% tryton-X 100, dodać przeciwciała anty-vWf i anty-CD62p (rozcieńczenie 1:200) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100 i odwirować przy 400 × g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać anty-mysie IgG-Alexa 594 i anty-królicze IgG-Alexa 488 (1:100). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać 20 μl anty-CD42b-APC. Następnie obrócić komórki na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w kroku 1.6.1 i przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, jak opisano w kroku 1.6.1.
- W celu określenia ploidalności należy zebrać komórki w 12 lub 13 dniu różnicowania. Dodaj 1 ml SB do umycia. Odwirować przy 400 × g przez 10 minut i wybarwić 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC w końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
- Przemyć raz 1 ml SB i ponownie zawiesić osad w 300 μl hipotonicznego buforu cytrynianowego (1,25 mM cytrynian sodu, 2,5 mM chlorek sodu, 3,5 mM dekstroza) zawierającego 20 μg/ml jodku propidyny i 0,05% Triton-X 100. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
- Dodać RNazę do końcowego stężenia 20 μg/ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Określ intensywność jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając od 30 000 do 50 000 zdarzeń populacji CD41-FITC+ (ryc. 2C).
2. Liczenie propłytek, oznaczanie liczby płytek krwi i aktywacja płytek krwi
- Zebrać komórki (od kroku 1.1) w 8 lub 9 dniu różnicowania i wysiać w 1 × 104 komórki/basenik na płytkach 48-dołkowych w 200 μl świeżego SFM uzupełnionego 50 ng/ml rhTPO. Hodowla przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
nuta: W celu oceny ilościowej należy wykonać trzy dołki nasienne. Ta niska gęstość jest wymagana do wizualizacji i zliczania MK zawierających propłytki. Propłytki zwykle zaczynają pojawiać się po 2 dniach hodowli. Szczyt przypada na 4 i 5 dzień.
- Policz liczbę MK zawierających propłytki w całym dołku w mikroskopie światła odwróconego przy użyciu obiektywów 10X lub 20X.
nuta: Preferowany jest podgrzewany (37 °C) stolik mikroskopowy, ponieważ utrzymywanie komórek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas powoduje kurczenie się przedłużeń propłytkowych. Propłytki są obserwowane jako długie wyprostowania od ciała MK. Każdy MK może mieć kilka wypukłości płytkowych. Wraz z rozwojem propłytek ciała MK zmniejsza się.
- Zebrać komórki i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić komórki 20 μl przeciwciałem anty-ludzkim CD41-FITC, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Obliczać procentową zawartość propłytkową MK (pbMK):
pbMK (%) = [(MK zawierające propłytki/dołek) / (Całkowita liczba komórek CD41+/dołek)] x 100
- Aby policzyć płytki krwi uwolnione do pożywki, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli.
- Barwienie 20 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD41-FITC przez 20 - 30 min w temperaturze 4 °C. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiedniego przeciwciała kontrolnego izotypu.
- Dodać 150 μl SB i 50 μl kulek do liczenia.
- W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy ustawić FSC i SSC na skalę logarytmiczną. Użyć normalnych płytek krwi ludzkiej z osocza bogatopłytkowego wybarwionego CD41-FITC, jak opisano w sekcji 2.4.1, aby ustawić bramkowanie dla płytek krwi (ryc. 3A).
- Analizuj barwione płytki krwi, licząc kulki za pomocą cytometrii przepływowej. Zbierz 1,000 zdarzeń liczenia koralików za pomocą wykresu punktowego FSC i SSC (Rysunek 3A). Oblicz liczbę płytek krwi na podstawie dodatnich zdarzeń CD41-FITC (ryc. 3B) za pomocą wzoru:
Płytki krwi na μl=[(liczba dodatnich zdarzeń CD41-FITC)/1,000 kulek)] x [(liczba kulek w 50 μl)/objętość próbki)]
- Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli. Dodać 1 ml buforu Tyrode'a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadkowych.
- Zebrać sklarowany osad i odwirować przy sile 800 x g przez 10 minut, aby uzyskać osadzanie cząstek wielkości płytek krwi.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu Tyrode'a. Dodać 20 μl przeciwciała PAC1-FITC i difosforanu adenozyny (ADP) do końcowego stężenia 20 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia odsetka zdarzeń FITC-dodatnich. Należy stosować świeże płytki krwi ludzkiej, które są traktowane w taki sam sposób, jak kontrola pozytywna (ryc. 3C).
