Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Streszczenie

Źródło: Perdomo, J., et al. Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z komórek CD34+ pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Różnicowanie megakariocytów

1. Nasiona 5 × 10⁵ komórek/ml komórek CD34 ⁺ w 2 ml SFM uzupełnionych 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (rhTPO) na studzienkę na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze. Jeśli komórki zlewają się, zanim będą potrzebne do analizy, zbierz komórki i podziel je na wiele dołków ze świeżą pożywką i rhTPO.
   nuta: Dwa lub trzy dołki powinny być przygotowane specjalnie w celu monitorowania różnicowania w różnych punktach czasowych (np. dni 7, 9 i 10).
2. Zbieraj komórki z odłożonych na bok studni w celu monitorowania różnicowania bez zakłócania komórek w innych studzienkach.
3. Wybarwić komórki 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC i 10 μl przeciwciała anty-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 w końcowej objętości 100 μl. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiednich przeciwciał kontrolnych izotypu. Inkubować przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C.
4. Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 - 300 μl SB. Przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.
5. Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrole izotypu, aby ustawić bramkowanie dla populacji dodatnich FITC i Alexa Flour 647. Przeanalizuj barwione próbki komórek, aby określić procent podwójnie dodatnich komórek CD41 ⁺ / CD42a ⁺, które reprezentują dojrzałe MK (Figura 1C).
6. Do mikroskopowej wizualizacji markerów powierzchni komórek należy wybarwić komórki, jak opisano w ppkt 1.3.
   1. Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 μl SB i wirować na szkiełku podstawowym o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut. Zamocuj komórki na szkiełku, zanurzając je w metanolu na 30 s. Wysuszyć na powietrzu, dodać 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (patrz tabela materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (rysunek 2A).
7. W celu wizualizacji antygenów wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić komórki w PBS i utrwalić paraformaldehydem (1% stężenie końcowe) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby przepuszczalność komórek należy dodać tryton-X 100 (0,1%) i inkubować przez 15 minut. Umyj komórki 2 ml PBS/0,1% triton-X 100. Zawiesić w 100 μl PBS/0,1% tryton-X 100, dodać przeciwciała anty-vWf i anty-CD62p (rozcieńczenie 1:200) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   1. Przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100 i odwirować przy 400 × g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać anty-mysie IgG-Alexa 594 i anty-królicze IgG-Alexa 488 (1:100). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać 20 μl anty-CD42b-APC. Następnie obrócić komórki na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w kroku 1.6.1 i przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, jak opisano w kroku 1.6.1.
8. W celu określenia ploidalności należy zebrać komórki w 12 lub 13 dniu różnicowania. Dodaj 1 ml SB do umycia. Odwirować przy 400 × g przez 10 minut i wybarwić 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC w końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
   1. Przemyć raz 1 ml SB i ponownie zawiesić osad w 300 μl hipotonicznego buforu cytrynianowego (1,25 mM cytrynian sodu, 2,5 mM chlorek sodu, 3,5 mM dekstroza) zawierającego 20 μg/ml jodku propidyny i 0,05% Triton-X 100. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
   2. Dodać RNazę do końcowego stężenia 20 μg/ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Określ intensywność jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając od 30 000 do 50 000 zdarzeń populacji CD41-FITC⁺ (ryc. 2C).

2. Liczenie propłytek, oznaczanie liczby płytek krwi i aktywacja płytek krwi

1. Zebrać komórki (od kroku 1.1) w 8 lub 9 dniu różnicowania i wysiać w 1 × 10⁴ komórki/basenik na płytkach 48-dołkowych w 200 μl świeżego SFM uzupełnionego 50 ng/ml rhTPO. Hodowla przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
   nuta: W celu oceny ilościowej należy wykonać trzy dołki nasienne. Ta niska gęstość jest wymagana do wizualizacji i zliczania MK zawierających propłytki. Propłytki zwykle zaczynają pojawiać się po 2 dniach hodowli. Szczyt przypada na 4 i 5 dzień.
2. Policz liczbę MK zawierających propłytki w całym dołku w mikroskopie światła odwróconego przy użyciu obiektywów 10X lub 20X.
   nuta: Preferowany jest podgrzewany (37 °C) stolik mikroskopowy, ponieważ utrzymywanie komórek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas powoduje kurczenie się przedłużeń propłytkowych. Propłytki są obserwowane jako długie wyprostowania od ciała MK. Każdy MK może mieć kilka wypukłości płytkowych. Wraz z rozwojem propłytek ciała MK zmniejsza się.
3. Zebrać komórki i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić komórki 20 μl przeciwciałem anty-ludzkim CD41-FITC, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Obliczać procentową zawartość propłytkową MK (pbMK):
   pbMK (%) = [(MK zawierające propłytki/dołek) / (Całkowita liczba komórek CD41+/dołek)] x 100
4. Aby policzyć płytki krwi uwolnione do pożywki, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli.
   1. Barwienie 20 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD41-FITC przez 20 - 30 min w temperaturze 4 °C. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiedniego przeciwciała kontrolnego izotypu.
   2. Dodać 150 μl SB i 50 μl kulek do liczenia.
   3. W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy ustawić FSC i SSC na skalę logarytmiczną. Użyć normalnych płytek krwi ludzkiej z osocza bogatopłytkowego wybarwionego CD41-FITC, jak opisano w sekcji 2.4.1, aby ustawić bramkowanie dla płytek krwi (ryc. 3A).
   4. Analizuj barwione płytki krwi, licząc kulki za pomocą cytometrii przepływowej. Zbierz 1,000 zdarzeń liczenia koralików za pomocą wykresu punktowego FSC i SSC (Rysunek 3A). Oblicz liczbę płytek krwi na podstawie dodatnich zdarzeń CD41-FITC (ryc. 3B) za pomocą wzoru:
      Płytki krwi na μl=[(liczba dodatnich zdarzeń CD41-FITC)/1,000 kulek)] x [(liczba kulek w 50 μl)/objętość próbki)]
5. Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli. Dodać 1 ml buforu Tyrode'a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 0,2 mM Na₂HPO₄, 12 mM NaHCO₃, 5,5 mM D-glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadkowych.
   1. Zebrać sklarowany osad i odwirować przy sile 800 x g przez 10 minut, aby uzyskać osadzanie cząstek wielkości płytek krwi.
   2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu Tyrode'a. Dodać 20 μl przeciwciała PAC1-FITC i difosforanu adenozyny (ADP) do końcowego stężenia 20 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia odsetka zdarzeń FITC-dodatnich. Należy stosować świeże płytki krwi ludzkiej, które są traktowane w taki sam sposób, jak kontrola pozytywna (ryc. 3C).

Wyniki

Rycina 1: Wykresy cytometrii przepływowej izolacji komórek CD34 + i różnicowania MK w hodowli. (A) Komórki jednojądrzaste (bramkowane, jak pokazano na lewym panelu) oczyszczone z ludzkiej krwi pępowinowej wybarwiono przeciwciałem anty-CD34-PE w celu określenia procentu komórek CD34 ⁺ w próbce (1,3%, prawy panel). (B) Po oddzieleniu frakcja dodatnia został...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych
Rekombinowany ludzki TPO	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-094-013
Rozpiętość trzpienia SFEM II	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 9605	Pożywki bez surowicy dla komórek CD34+
Cytometria przepływowa i odczynniki do barwienia komórek
Mysz PE anty-ludzka CD34	BD Nauki biologiczne	340669	Klon 8G12. Można to wykorzystać do kontroli czystości CD34. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.
Mysz PerCP anty-ludzka CD45	BD Nauki biologiczne	347464	Rozcieńczenie 1:10
Kontrola izotypu PerCP	BD Nauki biologiczne	349044	Rozcieńczenie 1:10
Mysz FITC anty-ludzka CD41a	BD Nauki biologiczne	340929	Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:5.
Mysz APC anty-ludzka CD42b	BD Nauki biologiczne	551061	Przeciwciało to może być również używane do wykrywania dojrzałych komórek MK (odsetek komórek dodatnich w zwykle niższy niż w przypadku anty CD42a). Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.
Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.
Alexa Fluor 647 Kontrola negatywna myszy	AbD Serotec	MCA928A647	Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Przeciwciało kontrolne izotypu
Czynnik anty von Willebranda królik poliklonalny	Księga Abcam	Zobacz materiał AB6994	Rozcieńczenie 1:200
Mysz V450 anty-humna CD41a	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 58425	Rozcieńczenie 1:20
Kontrola izotypu V450	BD Nauki biologiczne	580373	Rozcieńczenie 1:20
Przeciwciało PAC1-FITC	BD Nauki biologiczne	340507	Rozcieńczenie 1:10
Mysz monoklonalna anty CD62p	Księga Abcam	Zobacz materiał AB6632	Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 488 koza anty królik IgG	Invitrogen	A11008	Rozcieńczenie 1:100
Alexa Fluor 594 koza anty mysz IgG	Invitrogen	Zobacz materiał A11020	Rozcieńczenie 1:100
Ig Isotype Control koktajl-C	BD Nauki biologiczne	558659	Przeciwciało kontrolne izotypu
Jodek propidyny	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P4864
CountBright Absolutne koraliki do liczenia	Sondy molekularne, Invitrogen	Zobacz materiał C36950	Liczenie koralików
Materiałów
Falcon 5mL okrągłe probówki polipropylenowe FACS, z zatrzaskiem, sterylne	Technologie in vitro	352063
Szkiełka szklane	Menzel-Glaser	J3800AMNZ
Nośniki montażowe za pomocą DAPI	Laboratoria wektorowe	H-1200	Medium montażowe Antifade z DAPI
sprzęt
Mikroskop odwrócony	Księga Leica	Mikroskop odwrócony DMIRB
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Vert.A1 (Vert.A1
Analizator komórkowy	BD Nauki biologiczne	FACS Canto II
Wirówka cytospinowa	ThermoScientific (Nauka)	Cytospin 4
oprogramowanie
Oprogramowanie do analizy komórek	BD Nauki biologiczne	Oprogramowanie FACS Diva
Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek	Gwiazda drzewa	FlowJo
Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego	Zeiss	Zen 2 niebieska edycja