$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. 3D Hodowla narządów grasicy w celu wygenerowania iTE
- Zbierz płaty grasicy płodu myszy i rozmieść endogenne limfocyty za pomocą leczenia deoksyguanozyną (dGUO).
- W 7 dniu leczenia dGUO weź cztery nowe 10-centymetrowe szalki i napełnij każdą z nich 20 ml kompletnego podłoża (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanylo-L-glutamina + 1x pirogronian sodu + 1x minimalna niezbędna pożywka z aminokwasami endogennymi (MEM-NEAA) + 1x penicylina-streptomycyna + [1:1000] 2-merkapto etanol).
- Przenieś wszystkie membrany nitrocelulozowe z płatkami grasicy do jednego 10 cm naczynia. Odłącz poszczególne płaty od błony za pomocą kleszczy, umożliwiając ich zanurzenie w pożywce. Wyrzuć membrany. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Przenieść płaty grasicy do nowego 10-centymetrowego naczynia z kompletną pożywką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy.
- Za pomocą kleszczy przymocuj płaty grasicy do naczynia (pojedynczo), a drugą ręką wykonaj nacięcie o głębokości 100–200 μm pośrodku i przedłuż połowę średnicy płata, aby ułatwić migrację progenitorów limfocytów T do płata.
- Przenieś płaty grasicy do nowego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego kompletną pożywką różnicującą (kompletna pożywka + 5 ng/ml mysiej interleukiny-7 (IL-7) + 5 ng/ml mysiego liganda Flt3 (FLT3L) + 5 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF)).
- Opcjonalnie, jeśli używasz płytek hodowlanych 3D z siatkami dolnego i górnego poziomu, wypełnij obie siatki sterylnym PBS, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu wiszących kropli.
- Przenieść 30 μl kompletnej pożywki zawierającej jeden płat grasicy poddany działaniu dGuo z kroku 1.6 do każdego dołka płytki hodowlanej 3D.
- Zebrać nieprzylegające komórki linii T (niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC) z kohodowli OP9 / DLL1 (dni 16-21) i ponownie zawiesić w 2–5 x 10 3 komórek linii T na 20 μl pożywki.
- Dodać 20 μl zawiesiny komórek linii T do każdego płata grasicy na płytce hodowlanej 3D. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Ustawić pipetę P200 na 30 μl i po kilkukrotnym pipetowaniu odessać pożywkę z każdej studzienki, aby usunąć wszystkie komórki otaczające płaty grasicy. Wyrzucić pożywkę i dodać 30 μl kompletnej pożywki. Powtórz tę procedurę 5-7 razy, aby usunąć wszelkie dodatkowe niedojrzałe limfocyty T, które nie migrują do płatów. Następnie należy wymieniać 25–30 μl pożywki dziennie.
- Potwierdź tworzenie się aureoli emigrantów grasicy pochodzących z iPSC (iTE) wokół płatów począwszy od 4-5 dni za pomocą mikroskopii świetlnej.
- Codziennie zbieraj iTE, pipetując media bez zakłóceń płatkowych. Zmieniaj nośniki codziennie i kontynuuj zbieranie przez około 12 dni.
- Pobrane iTE są gotowe do użycia do analiz molekularnych (ryc. 1, ryc. 2, ryc. 3 i ryc. 4) lub eksperymentów transplantacyjnych in vivo.
