$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano na rysunku 1.
UWAGA: Początkowa liczba komórek i ich żywotność są silnie skorelowane z czasem od pobrania narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, komórki NK mogą nadal ekspansować się przy wysokiej czystości i żywotności do 24 godzin później.
- Zidentyfikuj żywe obszary tkanek w celu uzyskania limfocytów z tkanek i skrawków za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego.
- Umieść tkanki w 30 ml HBSS (bez wapnia lub magnezu) i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do przygotowania do izolacji.
- Zmiel tkankę w kostkę o długości <0,5 cm za pomocą sterylnych żyletek lub nożyczek i kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Przygotuj 1x roztwór kolagenazy dożylnej (1 mg / ml), rozcieńczając 10x zapas w HBSS (10x Kolagenaza IV: 10 mg / ml lub ~ 200 U / ml).
- Umieść zmielone kawałki tkanki w probówkach dysocjatora tkanek. Napełnij probówki nie więcej niż 4 g chusteczki i zanurz kawałki tkanki w ~10 ml 1x kolagenazy IV.
nuta: Nie zaleca się stosowania DNazy I, ponieważ może ona nieznacznie zmniejszyć żywotność i wydajność NK. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi używanymi rurkami do dysocjacji tkanek.
- Umieścić probówki dysocjatora tkanek w dysocjatorze tkankowym i zmiksować w temperaturze 37 °C, aby dokładnie zmielić tkankę.
nuta: W przypadku tkanki wątroby może to potrwać ponad 30 minut. W przypadku bardziej kruchych tkanek może wystarczyć około 15 minut. Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat określonych probówek do dysocjacji tkanek i zastosowanego dysocjatora tkankowego.
- Wyjmij probówki dysocjatora tkanek i przetrzyj przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 μm za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 5 ml. Zebrać eluent i wyrzucić duże, niestrawione fragmenty.
- Odwirowywać eluent w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
- Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem (PVP), aby usunąć komórki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zanieczyściłyby końcową frakcję limfocytów.
- Aby przygotować 1x krzemionkę pokrytą PVP, użyj rozcieńczenia 9:1 krzemionki pokrytej PVP w 10x PBS.
nuta: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat konkretnej użytej krzemionki pokrytej PVP.
- Aby przygotować 30% krzemionki pokrytej PVP, rozcieńczyć 1x krzemionkę pokrytą PVP za pomocą PBS / HBSS.
- Wirować osad komórkowy o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki R-10.
nuta: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek R-10.
- Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 ml Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych.
- Rozdzielić warstwy, wirując przy 400 x g przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem lub przy najniższym ustawieniu. Ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki.
- Przepłukać komórki 10 ml pożywki i przystąpić do zliczania komórek, cytometrii przepływowej, porcjowania i zamrażania komórek lub pierwotnego protokołu ekspansji NK.
