Ekspansja ex vivo komórek NK z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Abstract

Źródło: Ma, M., et al. Metoda NK (Natural Killer) i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje technikę ekspansji komórek NK (natural killer) bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą linii komórkowej zasilającej. PBMC są hodowane wspólnie z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami odżywiającymi limfoblastoidy eksprymujące interleukinę-21 związaną z błoną (mIL-21), a hodowla jest uzupełniana cytokinami interleukiną-2 (IL-2) i interleukiną-15 (IL-15). Razem ten koktajl ligandów prowadzi do przedłużonej ekspansji komórek NK o wysokiej czystości.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano na rysunku 1.

UWAGA: Początkowa liczba komórek i ich żywotność są silnie skorelowane z czasem od pobrania narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C p....

Results

Ryc. 1: Diagram ekspansji komórek NK z próbek narządów ludzkich w postaci stałej. Krótko mówiąc, uzyskane próbki ludzkiej wątroby są mielone na małe kostki w celu mechanicznego trawienia. Zdysocjowane komórki są następnie izolowane za pomocą krzemionki pokrytej PVP i pożywki do separacji limfocytów. Ponadto komórki NK są rozszerzane przy użyciu protokołu ekspansji opisanego na rysunku 2

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-dołkowa płytka G-REX	Wilson Wilk	80240M	Do rozbudowy ogniw NK
AF647-sprzężony fragment AffiniPure F(ab')2 kozioł anty-ludzki IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	109-606-088	Do cytometrii przepływowej
Kolagenaza IV	Sigma	Zobacz materiał C4-22-1G	Do izolacji TIL
Pożywki do kriokonserwacji	Corning	35-010-CV	90%
Składnik: Płodowa surowica bydlęca (FBS)
Pożywki do kriokonserwacji	Sigma	D2050	10%
Składnik: Dimetylosulfotlenek (DMSO)
Rurki C GentleMACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-093-237	Do izolacji TIL
GentleMACS Octo	Miltenyi Biotec	cytat	Do izolacji TIL
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS - bez wapnia lub magnezu)	Rybak termiczny	14170120	Do izolacji TIL
Człowiek IL-15	Peprotech	200-15	Do rozbudowy ogniw NK
Ludzki samolot IL-2	Peprotech	200-02	Do rozbudowy ogniw NK
Napromieniowane ogniwa zasilające 221-mIL21	Wygenerowane w laboratorium doktora Dongfang Liu		Zamrożone w pożywkach kriokonserwacyjnych
Pożywki do separacji limfocytów	Corning	25-072-CV	Do izolacji TIL
PE anty-ludzki klon CD3 HIT3a	Legenda biologiczna	300308	Do cytometrii przepływowej
PE/Cy7 anty-ludzki klon CD56 (NCAM) 5.1H11	Legenda biologiczna	362509	Do cytometrii przepływowej
Percoll	GE Opieka zdrowotna	17089101	Do izolacji TIL
Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)	Nowojorskie Centrum Krwiodawstwa		Wyizolowane z osocza zdrowych dawców, zamrożone w pożywkach kriokonserwacyjnych
Nośniki R-10	Firma VWR	45000-404
Składniki: RPMI 1640
Nośniki R-10	Firma VWR	45000-304	1 proc
Składnik: L-glutamina
Nośniki R-10	Firma VWR	45000-652	1 proc
Składnik: Penicylina Streptomycyna
Nośniki R-10	Corning	35-010-CV	10%
Składnik: Płodowa surowica bydlęca (FBS)
Błękit trypanowy	Corning	25-900-Cl	Do zliczania komórek