Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano na rysunku 1.
UWAGA: Początkowa liczba komórek i ich żywotność są silnie skorelowane z czasem od pobrania narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, komórki NK mogą nadal ekspansować się przy wysokiej czystości i żywotności do 24 godzin później.
- Zidentyfikuj żywe obszary tkanek w celu uzyskania limfocytów z tkanek i skrawków za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego.
- Umieść tkanki w 30 ml HBSS (bez wapnia lub magnezu) i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do przygotowania do izolacji.
- Zmiel tkankę w kostkę o długości <0,5 cm za pomocą sterylnych żyletek lub nożyczek i kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Przygotuj 1x roztwór kolagenazy dożylnej (1 mg / ml), rozcieńczając 10x zapas w HBSS (10x Kolagenaza IV: 10 mg / ml lub ~ 200 U / ml).
- Umieść zmielone kawałki tkanki w probówkach dysocjatora tkanek. Napełnij probówki nie więcej niż 4 g chusteczki i zanurz kawałki tkanki w ~ 10 ml 1x kolagenazy IV.
nuta: Nie zaleca się stosowania DNazy I, ponieważ może ona nieznacznie zmniejszyć żywotność i wydajność NK. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi używanymi rurkami do dysocjacji tkanek.
- Umieścić probówki dysocjatora tkanek w dysocjatorze tkankowym i zmiksować w temperaturze 37 °C, aby dokładnie zmielić tkankę.
nuta: W przypadku tkanki wątroby może to potrwać ponad 30 minut. W przypadku bardziej kruchych tkanek może wystarczyć około 15 minut. Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat określonych probówek do dysocjacji tkanek i zastosowanego dysocjatora tkankowego.
- Wyjmij probówki dysocjatora tkanek i przetrzyj przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 μm za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 5 ml. Zebrać eluent i wyrzucić duże, niestrawione fragmenty.
- Odwirowywać eluent w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
- Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem (PVP), aby usunąć komórki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zanieczyściłyby końcową frakcję limfocytów.
- Aby przygotować 1x krzemionkę pokrytą PVP, użyj rozcieńczenia 9:1 krzemionki pokrytej PVP w 10x PBS.
nuta: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat konkretnej użytej krzemionki pokrytej PVP.
- Aby przygotować 30% krzemionki pokrytej PVP, rozcieńczyć 1x krzemionkę pokrytą PVP za pomocą PBS / HBSS.
- Wirować osad komórkowy o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki R-10.
nuta: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek R-10
- Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 ml Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych.
- Rozdzielić warstwy, wirując przy 400 x g przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem lub przy najniższym ustawieniu. Ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki.
- Przepłukać komórki 10 ml pożywki i przystąpić do zliczania komórek, cytometrii przepływowej, porcjowania i zamrażania komórek lub pierwotnego protokołu ekspansji NK.
2. Pierwotna ekspansja komórek NK z PBMC (lub CB lub tkanek narządowych) (Dzień 0), jak pokazano na rysunku 2.
- Rozmrozić zamrożony PBMC i zamrożone, napromieniowane komórki zasilające w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Przemyć oddzielnie PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma (napromieniowanych Gy) komórek 221-mIL-21 przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut za pomocą 10 ml pożywki R-10.
- Zaoszczędź 1 x 106 komórek PBMC do cytometrii przepływowej.
nuta: Początkowa czystość komórek NK jest ważnym czynnikiem przy obliczaniu szybkości ekspansji komórek NK.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki R-10. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego.
- Wymieszać 5 x 106 komórek PBMC z 10 x 106 komórek 100 napromieniowanych Gy-221 komórek 221-mIL-21 na specjalnej płytce 6-dołkowej (patrz Tabela materiałów).
- Dodać 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) (patrz tabela materiałów).
- Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Zastąp pożywkę pożywką R-10 uzupełnioną ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) w celu utrzymania komórek NK co 3-4 dni.
nuta: Utrzymuj mniej niż 20 x 106 komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie podłoża. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 106 komórek.
- Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.
