Artykuł metodologiczny

Biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•Hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

14.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3059

⸱

21 września 2011

 ,  , 
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 3School of Medicine, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę in vitro przygotowywania funkcjonalnych kompleksów białkowych receptora glikokortykoidowego (GR)•hsp90 z oczyszczonych białek oraz lizatów komórkowych. Metoda wykorzystuje immunoadsorpcję rekombinowanego GR, po której następuje usuwanie soli (salt-stripping) i rekonstytucja kompleksu białkowego. Omówiono znaczenie kofaktorów i warunków buforowych, a także potencjalne zastosowania tej metody.

Streszczenie

Hsp90 jest niezbędnym i wysoce rozpowszechnionym białkiem opiekuńczym (chaperoną), które reguluje ponad 150 białek sygnałowych eukariotów, w tym czynniki transkrypcyjne (np. receptory jądrowe, p53) oraz kinazy białkowe (np. kinazy Src, Raf, Akt) zaangażowane w cykl komórkowy, tumorigenezę, apoptozę oraz liczne eukariotyczne szlaki sygnałowe 1,2. Spośród wielu tych białek „klientów” hsp90, najlepiej scharakteryzowany jest proces składania kompleksów receptor steroidowy•hsp90 (Rysunek 1). Przedstawiamy tutaj adaptacyjny test immunoprecypitacji receptora glikokortykoidowego (GR) oraz metodę rekonstytucji GR•hsp90 in vitro, które mogą być łatwo wykorzystane do badania aktywności funkcjonalnej eukariotycznego hsp90, wiązania ligandu receptora steroidowego zapośredniczonego przez hsp90 oraz wymagań co do kofaktorów białek opiekuńczych. Przykładowo, test ten może być użyty do weryfikacji wymagań kofaktorowych hsp90 oraz wpływu dodania egzogennych związków do procesu rekonstytucji.

GR okazał się szczególnie użytecznym systemem do badania hsp90, ponieważ receptor musi być związany z hsp90, aby posiadać otwartą szczelinę wiążącą ligand, która jest dostępna dla steroidów 3. Endogenny, niezwiązany z ligandem GR występuje w cytoplazmie komórek ssaków w formie niekowalencyjnie związanej z hsp90. W endogennym heterokompleksie GR•hsp90 szczelina wiążąca ligand GR jest otwarta i zdolna do wiązania steroidu. Jeśli hsp90 odłączy się od GR lub jeśli jego funkcja zostanie zahamowana, receptor nie jest w stanie wiązać steroidu i wymaga rekonstrukcji heterokompleksu GR•hsp90 przed przywróceniem aktywności wiązania steroidów 4. GR można immunoprecypitować z cytosolu komórkowego przy użyciu przeciwciała monoklonalnego, a białka takie jak hsp90 tworzące kompleks z GR można analizować za pomocą western blotu. Aktywność wiązania steroidów immunoprecypitowanego GR można określić poprzez inkubację osadu immunologicznego z [3H]steroidem.

Poprzednie eksperymenty wykazały, że otwarcie szczeliny wiążącej ligand GR za pośrednictwem hsp90 wymaga hsp70, drugiego białka opiekuńczego, które jest również niezbędne dla żywotności komórek eukariotycznych. Aktywność biochemiczna hsp90 i hsp70 jest katalizowana przez białka kopekuńcze Hop, hsp40 oraz p23 5. Wielobiałkowy kompleks opiekuńczy zawierający hsp90, hsp70, Hop i hsp40 występuje endogennie w cytoplazmie komórek eukariotycznych, a lizat retikulocytów stanowi bogate w białka opiekuńcze źródło białek 6.

W przedstawionej metodzie GR jest immunoadsorbowany z cytozolu komórkowego, a następnie pozbawiany endogennego mechanizmu chaperonowego hsp90/hsp70 przy użyciu łagodnych warunków zasoloneń. Tak oczyszczony GR jest następnie inkubowany z lizatem retikulocytów, ATP oraz K+, co prowadzi do rekonstytucji heterokompleksu GR•hsp90 i reaktywacji aktywności wiązania steroidów 7. Metoda ta może być wykorzystana do badania wpływu różnych kofaktorów chaperonowych, nowych białek oraz eksperymentalnych inhibitorów hsp90 lub GR w celu określenia ich funkcjonalnego znaczenia dla zależnego od hsp90 wiązania steroidów 8-11.

Protokół

1. Przygotowanie cytozolu komórkowego zawierającego funkcjonalny GR

  1. Uwaga techniczna: Wszystkie bufory powinny być przechowywane w lodówce, a każdy etap tego protokołu, w tym wirowanie i inkubacja, powinien być przeprowadzany w lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Niska temperatura jest niezbędna, aby zapobiec degradacji GR i kompleksów białkowych.
  2. Używając wirówki chłodzącej, należy uzyskać osad komórkowy o objętości ˜1-5 ml komórek wykazujących wysoką koncentrację funkcjonalnego GR. Przykładami źródeł komórek bogatych w GR są fibroblasty mysie L929, które wykazują wysoką koncentrację endogennego GR, oraz komórki Sf9 zainfekowane rekombinowanym bakulowirusem GR (np. bakulowirusem p2Bac-mGR 12). Z jednego litra hodowli komórek Sf9 zainfekowanych bakulowirusem uzyskuje się około 15-20 ml upakowanych komórek. Przed zbiorem komórki powinny znajdować się w fazie wzrostu wykładniczego. Zawiesinę komórkową wirować przy 5,0 × g przez 5 min.
  3. Osad komórkowy płukać trzykrotnie 15 ml roztworu soli Hanksa (HBSS). Po każdym płukaniu delikatnie resuspender osad, a następnie wirować przy 5,0 × g przez 5 min. Po ostatnim płukaniu całkowicie usunąć supernatant.
  4. Przygotować 7,5 ml buforu homogenizacyjnego zawierającego bufor HEM (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM molibdenu sodu, pH 7.4), 1 mM fenylometylosulfonylu fluorurku (PMSF) oraz 3 rozkruszone tabletki inhibitora proteaz Complete-Mini. PMSF i tabletki Complete-Mini zapobiegają proteolizie podczas kolejnych etapów. Tabletki Complete-Mini można łatwo rozetrzeć na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka. Do osadu komórkowego dodać 1,5 objętości buforu homogenizacyjnego.
  5. Komórki poddać rozbiciu za pomocą homogenizacji w homogenizatorze Dounce'a (50 pociągnięć) lub techniką zamrażania i rozmrażania (3 cykle). Homogenizacja w homogenizatorze Dounce'a może pozwolić na lepsze zachowanie endogennych kompleksów białkowych GR•hsp90 i jest szybsza w wykonaniu. Metoda zamrażania i rozmrażania daje badaczowi możliwość przerwania protokołu na tym etapie i kontynuowania go w późniejszym czasie. Homogenizację w homogenizatorze Dounce'a należy przeprowadzać z urządzeniem umieszczonym w wiadrze z lodem, aby zapobiec degradacji białek. Zamrażanie i rozmrażanie można przeprowadzić, zamrażając probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę osadu komórkowego i buforu homogenizacyjnego ciekłym azotem, suchym lodem lub w inkubatorze przy -20 °C, a następnie rozmrażając w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C.
  6. Oddzielić cytozol zawierający GR od cząsteczkowych pozostałości rozbitych komórek za pomocą ultrawirowania. Homogenat przenieść do wytrzymałych probówek do ultrawirówki, zrównoważyć probówki masowo w parach i wirować przy 10,0 × g przez 30 minut.
  7. Pobrać cytozol (supernatant) i przechowywać go w temperaturze -20 °C w alikwotach 50 μl w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu długoterminowego przechowywania. Aby zachować maksymalną aktywność funkcjonalnego GR, alikwoty należy zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie lub inkubować przez 30 sekund w kąpieli z metanolu i suchego lodu przed przechowywaniem. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu skóry z czynnikiem chłodzącym.

2. Immunoadsorpcja GR z cytozolu komórkowego

  1. Uwaga techniczna: Rycina 2 przedstawia schematycznie kroki 2-5 niniejszego protokołu.
  2. Przygotować mieszaninę do immunoadsorpcji zawierającą monoklonalne przeciwciało immunoglobuliny G (IgG) skierowane przeciwko GR w celu immunoadsorpcji receptora przygotowanego w kroku 1. W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml połączyć 10 μl rozmrożonego cytozolu zawierającego GR, 20 μl buforu TEGM (8 mM TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molibdanu, 10% (v/v) glicerolu, pH 7,6), 10 μl 20% zawiesiny protein A-Sepharose (PAS) (v/v, przygotowanej w buforze TEGM) oraz 5 μg monoklonalnego przeciwciała IgG przeciwko GR (np. BuGR2). Molibdan jest zawarty w buforze TEGM, aby pomóc w stabilizacji heterokompleksu GR-hsp90, co może być przydatne przy badaniu aktywności wiązania steroidów endogennego heterokompleksu 13.
    1. Przeciwciało przeciwko GR jest dostępne handlowo jako oczyszczone białko. Alternatywnie można je uzyskać poprzez dodanie 10 μl wodnej treści jamy brzusznej (ascites) zawierającej IgG przeciwko GR do mieszaniny do immunoadsorpcji. Wodna treść jamy brzusznej jest produkowana przez myszy, którym wstrzyknięto komórki hybrydomy przeciwko GR (np. komórki hybrydomy FiGR 14); przybliżone stężenie przeciwciał uzyskane z wodnej treści jamy brzusznej i wykorzystane w tych eksperymentach wynosiło 0,5 μg/μl, co zmierzono metodą Bradforda.
    2. Przygotować próbkę kontrolną negatywną, używając cytozolu zawierającego GR, buforu TEGM oraz PAS (jak opisano powyżej) i 5 μg IgG, które nie rozpoznaje GR, hsp90 ani innych białek opiekuńczych (tzw. przeciwciało „nieimmunologiczne”).
    3. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar kulek PAS, podczas przenoszenia PAS z 20% zawiesiny do probówek z próbkami należy użyć przyciętego końcówki pipety P-20. Przycięte końcówki pipet przygotowuje się poprzez odcięcie 2-3 mm z końca dostępnych handlowo końcówek P-20, zwiększając w ten sposób otwór końcówki pipety.
  3. Próbki umieścić na pionowym kole rotacyjnym i inkubować przez minimum 2 godziny przy stałym obrocie. Próbki można inkubować do 8 godzin bez utraty aktywności.
  4. Po zakończeniu inkubacji do immunoadsorpcji usunąć niezwiązane białka z osadu przeciwciało-PAS („immunootsadu”) poprzez wirowanie. Oddzielić nadosady od immunootsadów, wirując w wirówce chłodzącej zgodnie z programem: 1 minuta przy 10 0 × g, a następnie dwukrotnie przemyć 1 ml buforu TEGM i wymieszać wortexie. Po wirowaniu i pomiędzy przemyciami usunąć nadosad, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    1. Usunąć cały nadosad po drugim przemyciu. Aby upewnić się, że żadna część osadu nie zostanie przypadkowo odessana, do końcowego odessania nadosadu należy użyć zgniecionego końcówki pipety P-20. Zgniecione końcówki pipet przygotowuje się poprzez spłaszczenie dostępnych handlowo końcówek P-20 za pomocą pęsety.

3. Dysocjacja endogennego hsp90 z immunopelletu GR („odsolenie”)

  1. Do wypłukanego immunopelletu przygotowanego w kroku 2 dodać 35 μl buforu TEG (bufor TEGM bez molibdenianu sodu) oraz 45 μl 5 M NaCl (końcowe stężenie NaCl = 0,5 M).
  2. Próbki umieścić na pionowym rotatorze i inkubować przez 1,5 godziny przy ciągłym obrocie. Inkubację można prowadzić do 2 godzin; jednak dłuższy czas inkubacji może prowadzić do zmniejszenia odzysku białka i niższej aktywności funkcjonalnej.
  3. Niezwiązane białka usunąć z immunopelletu poprzez wirowanie. Próbki wirować przez 1 minutę przy 10 00 × g. Wypłukać raz 1 ml buforu TEG i raz 1 ml buforu HEPES 10 mM, pH 7,4.
  4. Po zakończeniu drugiego płukania usunąć cały supernatant za pomocą zaciętej końcówki pipety P-20, uważając, aby nie naruszyć immunopelletu.

4. Rekonstytucja heterokompleksu GR•hsp90 z wykorzystaniem chaperonów molekularnych, kofaktorów i ATP

  1. Uwaga techniczna: Można przetestować szereg warunków eksperymentalnych, dodając do przygotowanej poniżej mieszaniny rekonstytucyjnej dodatkowe białka, kofaktory, aktywatory lub inhibitory. Całkowita objętość mieszanin rekonstytucyjnych powinna wynosić <120 μl.
  2. Do każdego immunogranu pozbawionego soli, przygotowanego w kroku 3, dodać mieszaninę rekonstytucyjną zawierającą 50 μl źródła chaperonów molekularnych oraz 5 μl systemu generującego ATP (10 mM HEPES, 50 mM ATP, 250 mM fosforanu kreatyny, 20 mM octanu magnezu, 10 U/ml kinazy fosfokreatynowej, pH 7,4).
    1. Reakcje rekonstytucji można zwiększyć, uzupełniając mieszaninę rekonstytucyjną o 50 μl buforu HKD (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 5 mM ditiotreitolu (DTT), pH 7,4) oraz dodatkowe 5 μl systemu generującego ATP. Ten krok można pominąć, jeśli zaobserwowano wystarczającą rekonstytucję i wiązanie steroidów. KCl zwiększa aktywność ATPase hsp70, a DTT chroni białka zawierające cysteinę przed utlenianiem 9.
    2. Rekomendowanym źródłem chaperonów molekularnych jest komercyjnie dostępny lizat retikulocytów królika. Można również stosować poszczególne chaperony molekularne oczyszczone z lizatu retikulocytów lub wyrażone rekombinacyjnie (np. 15 μg hsp90, 15 μg hsp70, 0,6 μg Hop, 6 μg p23 i 0,125 μg hsp40 w buforze HKD).
  3. Próbki inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C dokładnie przez 20 minut. Co 1-2 minuty delikatnie potrząsać probówkami, aby rozbić granulat i wymieszać roztwór rekonstytucyjny.
  4. Dodać 1 ml buforu TEGM, wymieszać wortexie i odwirować przy 10,0 × g przez 1 minutę. Odmienić supernatant i go usunąć, uważając, aby nie naruszyć granulatu. Powtórzyć czynność łącznie do trzech płukań. Po zakończeniu ostatniego płukania całkowicie usunąć cały supernatant za pomocą ściętej końcówki pipety P-20.

5. Analiza zrekonstytuowanych kompleksów białkowych i aktywności wiązania ligandu

  1. Białka w zrekonstytuowanym immunoosadzie można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnej denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE), elektroforezy mikroprzepływowej (np. Bio-Rad Experion) oraz westernu (Ryc. 3). Uwaga techniczna: Obecnie dostępne są doskonałe protokoły opisujące SDS-PAGE 15 oraz western blotting 16, opracowane przez innych badaczy.
    1. Dodać 50 μl buforu do próbek SDS-PAGE zawierającego β-merkaptoetanol i wymieszać w wirówce vortex. Konkretne receptury buforów do próbek różnią się od siebie. Należy wybrać jedną z nich na podstawie zaleceń producenta stosowanego systemu elektroforetycznego.
    2. Inkubować przez 5 minut w wrzącej łaźni wodnej lub w elektronicznym bloku grzewczym w temperaturze 10 °C.
    3. Wirować przy 10 0 × g przez 1 minutę. Przeciwciało immunoadsorbujące, GR oraz białka w kompleksie z GR zostaną od siebie oddzielone i uwolnione do nadsączu buforu do próbek.
    4. Przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi za pomocą ściętej końcówki pipety P-200. Odrzucić osad. Próbka jest teraz przygotowana do analizy przy użyciu dostępnych komercyjnie systemów SDS-PAGE lub elektroforezy mikroprzepływowej. Wykonać wybraną technikę zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Analiza western blot po SDS-PAGE pozwala na jednoznaczne zidentyfikowanie immunoadsorbowanego GR oraz białek opiekuńczych w kompleksie z GR po inkubacji rekonstytucyjnej. Użyć monoklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciwko GR (BuGR2), hsp90 (AC8), hsp70 (N27F3-4) oraz przeciwciał przeciwko białkom koperonowym w celu wykrycia głównych składników kompleksu białkowego GR•hsp90.
  2. Funkcjonalną aktywację GR po usunięciu soli w następstwie rekonstytucji kompleksu białkowego GR•hsp90 można zidentyfikować, badając aktywność wiązania steroidów przy użyciu [3H]steroidu (Ryc. 4). W dalszej części protokołu należy przestrzegać niezbędnych środków ostrożności podczas bezpiecznego obchodzenia się z próbkami i odpadami trytyjnymi.
    1. Do zrekonstytuowanego immunoosadu dodać 47,5 μl buforu HEM oraz 2,5 μl 2 μM [3H]deksametazonu (końcowe stężenie steroidu = 10 nM).
    2. Delikatnie wymieszać osad, uważając, aby zminimalizować ilość próbki osadzającej się na ściankach probówki do mikrocentryfugi.
    3. Inkubować przez noc na lodzie. Podczas tej inkubacji nie trzeba obracać ani mieszać probówek z próbką.
    4. Dodać 1 ml buforu TEGM, delikatnie wymieszać i wirować przy 10 0 × g przez 1 minutę. Odrzucić nadsącz, pamiętając, że zawiera on niezwiązany [3H]steroid. Powtórzyć czynność, wykonując łącznie 3 płukania buforem TEGM.
    5. Po zakończeniu ostatniego płukania całkowicie usunąć cały nadsącz za pomocą ściętej końcówki pipety P-20. Osad zawiera GR, hsp90 i inne białka opiekuńcze w kompleksie z GR oraz [3H]steroid specyficznie związany z receptorem. Wiązanie niespecyficzne można obliczyć, dodając do mieszaniny inkubowanej przez noc 10-krotną nadwyżkę nietrytyjnego deksametazonu. Jako alternatywną kontrolę negatywną przeciwciało immunoadsorbujące anty-GR dodane w kroku 2.2 można zastąpić przeciwciałem niewiążącym GR (NI).
    6. Wypłukane immunoosady zawiesić w 20 μl buforu TEGM i przenieść do 10 ml fiolek scyntylacyjnych za pomocą ściętej końcówki pipety P-20.
    7. Do fiolek dodać 4,8 ml koktajlu scyntylacyjnego i wymieszać w wirówce vortex.
    8. Ilość [3H]steroidu wiążącego się zrekonstytuowanym kompleksem białkowym GR•hsp90 można oznaczyć za pomocą płynnej spektrometrii scyntylacyjnej.

6. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywne dane z SDS-PAGE oraz western blot przedstawiono na rysunku 3. Endogenny heterokompleks GR•hsp90 zostaje immunoadsorbowany z cytosolu komórkowego przy użyciu przeciwciała anty-GR, a poszczególne białka współimmunoadsorbowane z GR są wizualizowane za pomocą barwienia Coomassie (Rys. 3A). Potwierdzenie tożsamości białkowej dowolnego komponentu immunoosadu na dowolnym etapie badania rekonstrukcji można przeprowadzić poprzez wyznaczenie masy cząsteczkowej w SDS-PAGE oraz western blotting z użyciem przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko badanemu białku.

Zrekonstytuowane heterokompleksy GR•hsp90 przedstawiono przy użyciu danych z mikrofluidycznej elektroforezy Experion (Ryc. 3C i 3D) oraz analizy western blot (Ryc. 3B). Specyficzność immunoadsorpcji GR potwierdzono, zastępując przeciwciało przeciw-GR przeciwciałem nieimmunologicznym (Ryc. 3C, ścieżki NI IgG). Nawet przy zastosowaniu nadmiarowej ilości przeciwciał nieimmunologicznych nie immunoprecypitują się GR ani chaperony molekularne (por. na Ryc. 3C prążki białek GR, hsp90 i hsp70 obecne w ścieżkach immunoadsorpcji przeciw-GR oraz brak prążków w ścieżkach NI IgG). Podobnie, analizą western blot (Ryc. 3B) osadów immunologicznych po usunięciu soli i po rekonstytucji można potwierdzić dysocjację hsp90 oraz innych białek chaperonowych z GR pozbawionego soli. Łańcuch ciężki przeciwciała immunoadsorpcyjnego (HC) jest wykrywalny zarówno za pomocą barwienia Coomassie, jak i western blottingu, co służy do potwierdzenia, że w każdej ścieżce wizualizowane są osady immunologiczne o tej samej wielkości.

Aktywność wiązania steroidów przez immunoadsorbowany GR można badać dla wszystkich testowanych warunków; reprezentatywne dane dotyczące wiązania steroidów przedstawiono na Rysunku 4. Endogenne heterokompleksy GR•hsp90 są immunoadsorbowane, poddawane usuwaniu soli (salt-stripping) i rekonstytuowane. Przy użyciu lizu retikulocytów lub oczyszczonych białek aktywność wiązania steroidów rekonstytuowanego heterokompleksu GR•hsp90 zazwyczaj powraca do poziomu 75-10% aktywności wiązania endogennego GR•hsp90. Podobnie jak w przypadku danych z elektroforezy, zamiast przeciwciała anty-GR (I) można zastosować przeciwciało nieimmunologiczne (NI), aby służyło ono jako kontrola negatywna oraz pomiar nieswoistego wiązania [3H]steroidów.

Schemat cyklu maszynerii chaperonowej z kompleksami Hsp90, etapy sfałdowania białek napędzane przez ATP.
Rycina 1. Model montażu heterokompleksu GR•hsp90 oraz otwierania szczeliny wiążącej steroidy w GR. Maszyneria chaperonowa oparta na hsp90/hsp70 przekształca domenę wiążącą ligand GR z konformacji zwiniętej, w której szczelina wiążąca steroidy jest zamknięta i niedostępna dla hormonu, w konformację z otwartą szczeliną, która może zostać osiągnięta (zilustrowane ikoną heterocyklicznego steroidu). Maszyneria chaperonowa jest wstępnie zmontowana w komórce i powstanie samoistnie po zmieszaniu w roztworze oczyszczonych hsp90, hsp70 i Hop (Reakcja 1). Hop zawiera domenę powtórzeń tetratrykopeptydowych (TPR) składającą się z 34 aminokwasów (zilustrowaną jako ciemny półksiężyc), która w późniejszym etapie procesu dojrzewania heterokompleksu zostaje zastąpiona białkiem immunofilinowym zawierającym domenę TPR. Maszyneria otwiera szczelinę wiążącą steroidy w sposób zależny od ATP i K+w sposób zależny od ATP, po czym Hop oraz większość białek hsp70 i hsp40 ostatecznie opuszczają kompleks (przedstawiono jako ikonę przerywaną). Pod względem mechanistycznym hsp70 oddziałuje z GR przed hsp90 i przygotowuje receptor do oddziaływania z hsp90 oraz następującego otwarcia szczeliny. Doświadczalnie wykazano, że wiązanie steroidu i otwieranie szczeliny GR ulegają nasileniu, jeśli hsp90 i hsp70 są obecne jednocześnie. Heterokompleks jest stabilizowany przez przyłączenie kokaperony p23 hsp90, która utrzymuje hsp90 w konformacji związanej z ATP. Po opuszczeniu kompleksu przez Hop, do hsp90 może przyłączyć się wysokocząsteczkowa immunofilina (IMM), tworząc końcowy heterokompleks w takiej formie, w jakiej jest on izolowany z komórek. Adaptacja na podstawie Pratta i Tofta 1.

Schemat endogennego kompleksu GR-Hsp90; analiza oddziaływań białkowych z wynikami SDS-PAGE.
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie kroków 2-5 niniejszego protokołu. Receptor glukokortykoidowy (GR) jest immunoadsorbowany z cytozolu komórkowego przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko GR (FiGR) związanego z osadem białka A-Sefarozy. Hsp90 oraz inne białka opiekuńcze obecne w endogennym heterokompleksie GR•hsp90 są współimmunoadsorbowane wraz z GR, a GR zachowuje zdolność do wiązania steroidu. Hsp90 jest dysocjowane od GR poprzez łagodne traktowanie solą, określane jako stripping solny (Str). Szczelina wiążąca steroid w GR po strippingu solnym zamyka się, co uniemożliwia wiązanie steroidu. Pośrednie heterokompleksy GR•hsp90 zawierające hsp70, hsp40 i Hop, zdolne do wiązania steroidu, mogą zostać zrekonstytuowane (Recon) poprzez inkubację GR po strippingu solnym z oczyszczonymi białkami lub lizatem retikulocytów (Retic lysate) oraz kofaktorami. Aktywność wiązania steroidu oraz zawartość białek w immunoosadzie na każdym etapie mogą być identyfikowane poprzez nocną [3odpowiednio inkubacji steroidów i western blottingu.

Analiza elektroforezy białek, prążki żelowe, wykres fluorescencji szczegółowo przedstawiający białka GR, hsp70 oraz hsp90.
Rysunek 3. Elektroforetyczna analiza białek kompleksów immunoadsorbowanych. A, SDS-PAGE zrekonstytuowanego heterokompleksu GR•hsp90 obrazowany przy użyciu konwencjonalnego systemu elektroforetycznego, a następnie poddany elektrotransferowi i barwieniu Coomassie. Oprócz GR, hsp90 i hsp70 widoczne są łańcuch ciężki (HC) i łańcuch lekki (LC) przeciwciał. Migrację markerów masy cząsteczkowej (wyrażonej w kDa) zaznaczono po lewej stronie. B, Western blot immunopelletów zawierających GR po usunięciu soli (Str) oraz zrekonstytuowany heterokompleks GR•hsp90 (Recon). C, wirtualny żel zrekonstytuowanego heterokompleksu GR•hsp90 wygenerowany przy użyciu mikrofluidycznego systemu elektroforetycznego Experion. Uwzględniono dwie różne stężenia nieimmunnych (NI IgG) i immunnych (anty-GR) przeciwciał immunoadsorbujących. NI IgG służą jako kontrole negatywne. D, elektroferogram zrekonstytuowanego heterokompleksu GR•hsp90 otrzymany z próbki mikrofluidycznej elektroforezy Experion przedstawionej w trzeciej ścieżce panelu B. Zalety elektroforezy mikrofluidycznej obejmują konieczność zastosowania mniejszych objętości próbek, ograniczenie manipulacji cieczami i prac porządkowych po analizie, lepszą kwantyfikację oraz znacznie krótszy czas przebiegu próbek.

Wykres słupkowy wiązania steroidów; porównanie Endog, Str, Recon; naukowa wizualizacja danych.
Rysunek 4. Aktywność wiązania steroidów przez immunopelety po immunoadsorpcji endogennego receptora glikokortykoidowego (Enodg), GR pozbawionego soli (Str) oraz zrekonstytuowanego heterokompleksu GR•hsp90 (Recon). Oprócz immunoadsorpcji GR przy użyciu monoklonalnego przeciwciała immunoadsorbującego przeciwko GR (I), dla każdego stanu przygotowano próbki kontrolne negatywne z użyciem immunoglobulin nieimmunologicznych (NI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany powyżej test można dostosować do badania wielu warunków wpływających na działanie maszynerii chaperonowej opartej na hsp90/hsp70, a także na wiązanie steroidów przez GR. Jest on modyfikacją wcześniej opisanych metod 4,8,9,17 i został zaprojektowany tak, aby wykorzystać ostatnie postępy w technologii elektroforezy oraz być dostępnym dla szerszego grona badaczy. Do mieszaniny rekonstrukcji heterokompleksu GR•hsp90, opisanej w kroku 4 protokołu, można dodać dodatkowe kofaktory lub białka zainteresowania, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wybrane odczynniki do elektroforezy oraz oprogramowanie do analizy obrazów zostały dostarczone przez firmę Bio-Rad.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health GM086822, nagrody Hope Heart Institute Basic Sciences oraz programu College Science Research Program fundacji M. J. Murdock Charitable Trust. Wybrane odczynniki do elektroforezy oraz oprogramowanie do analizy obrazów zostały uprzejmie udostępnione przez firmę Bio-Rad.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki owadzie Sf9Invitrogendo ekspresji rekombinowanego mysiego GR z wykorzystaniem bakulowirusów
Komórki L929ATCCCRL-2173do przygotowania cytozolu z endogennym mysim GR (alternatywa dla ekspresji bakulowirusowej)
Komórki hybridoma FiGRATCCCRL-2173do przygotowania wodobrzusza zawierającego monoklonalne przeciwciało anty-GR (alternatywa dla oczyszczonego przeciwciała BuGR2)
Inhibitor proteaz Complete-Mini, bez EDTARoche Group11836170001
protein A-SepharoseSigma-AldrichP3391
Lizat retikulocytów królikaGreen Hectares (Oregon, WI)bogate źródło endogennego mechanizmu chaperonowego hsp90/hsp70
KreatynofosfokinazaSigma-AldrichC3755do systemu regeneracji ATP
FosfokreatynaSigma-AldrichP7936do systemu regeneracji ATP
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-GR (BuGR2)Pierce, Thermo ScientificMA1-510stosowane do immunoadsorpcji GR oraz jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-hsp90 (AC88)Enzo Life SciencesADI-SPA-830stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-hsp70 (N27F3-4)Enzo Life SciencesADI-SPA-820stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu
IgG z surowicy mysiejSigma-Aldrich038K7690stosowane jako przeciwciało nieimmunne do ujemnej kontroli immunoadsorpcji
Koniugat IgG przeciwko mysi z peroksydaząSigma-AldrichA4416stosowane jako przeciwciało drugorzędowe w western blottingu
Mikrofluidyczny system elektroforezy ExperionBio-Rad7007001alternatywa dla konwencjonalnego SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] deksametazonPerkinElmer, Inc.NET1192001MCprzestrzegać środków ostrożności

Bibliografia

  1. Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
  2. Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
  3. Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
  4. Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
  5. Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
  6. Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
  7. Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
  8. Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
  9. Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
  10. Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
  11. Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
  12. Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
  13. Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
  14. Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
  15. Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
  16. Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
  17. Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
  18. Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
  19. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
  20. Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
  21. Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Receptor glikokortykoidowykompleks Hsp90aktywno wi zania steroid wanaliza immunoprecypitacyjnalizat retikulocyt wanaliza Western blotelektroforeza SDS PAGEwi zanie liganda radioaktywnegowymagania dotycz ce kofaktor w bia ek opieku czych

Powiązane artykuły