$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie preparatów do przylegania komórek Raji
- Dodać 150 μl fibronektyny (100 μg/ml) na studzienkę do szkiełka z 8 mikrodołkami (szkiełko z plastikową komorą z dnem) i inkubować przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C. Ten substrat adhezyjny pozwoli na wiązanie komórek Raji z dnem studni (Krok 2), tworzenie żywych koniugatów z komórkami Jurkat (Krok 4) i wychwytywanie za pomocą mikroskopii poklatkowej (Krok 6), a także jest kompatybilne z opcjonalnym utrwalaniem paraformaldehydu (PFA).
UWAGA: Do utrwalania acetonu należy używać szkiełek ze szklaną dolną komorą i poli-L-lizyny (20 μg/ml) zamiast fibronektyny, ponieważ aceton rozpuszcza plastik. Szkiełko z 8 mikrodołkami (1 cm2 dołki, maksymalna objętość 300 μl) lub równoważne jest elastycznym i odpowiednim formatem.
- Odessać fibronektynę za pomocą pipety automatycznej o pojemności 200 μl i przemyć każdą studzienkę 200 μl PBS przez 2 minuty, delikatnie wstrząsając. Powtórz to pranie jeszcze raz. Na tym etapie szkiełko komorowe można przechowywać w PBS przez 1-2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
2. Przyleganie komórek Raji do szkiełek komory i znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC)
- Przenieś 10 ml zlewającej się (1-2 x 106 komórek/ml) hodowli wstępnej komórek Raji do 15 ml probówki z dnem w kształcie litery V. Dobrze wymieszaj i użyj 10 μl do policzenia komórek w komorze Neubauera lub równoważnej.
- Odwirować pozostałe komórki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić supernatant.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w ciepłym, kompletnym pożywce hodowlanej (RPMI 1640 uzupełniony 10% FCS, 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w stężeniu10-6 komórek/ml. Użyj równania podanego poniżej:
([ ]początkowy x Vpoczątkowy = [ ]końcowy x Vkońcowy), gdzie [ ]początkowy oznacza początkowe stężenie komórki, Vpoczątkowe = początkowa objętość zawiesiny komórki, [ ]końcowe = końcowe stężenie komórki, Vkońcowe = końcowa objętość zawiesiny komórki.
UWAGA: W zależności od stężenia komórek w hodowli wyjściowej, możliwe jest zebranie większej liczby komórek niż jest to potrzebne, ale ważne jest, aby utrzymać pozostałe komórki w hodowli (37 °C) do końca eksperymentu, aby zapobiec potencjalnym problemom (patrz krok 2.6).
- Oznacz komórki Raji, aby umożliwić ich identyfikację podczas tworzenia koniugatu synaptycznego. W tym eksperymencie znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC) przeprowadza się w kroku 2.4.2.
- Przenieść wymaganą liczbę komórek Raji z pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 2 ml. Do 8 szkiełek z komorą mikrodołkową potrzeba łącznie 1,6 ml zawiesiny komórek (200 μl na studzienkę).
- Dodać CMAC do końcowego stężenia 10 μM. Utrzymuj komórki w ciemności, przykrywając probówkę folią aluminiową, ponieważ CMAC jest wrażliwy na światło. Potrzeba 200 μl zawierających 2 x 10 5 komórek Raji na 1 cm2 studzienki. Tak więc, jeśli trzeba przygotować 8 studzienek, wymagane jest 1,6 x 106 komórek Raji.
UWAGA: Znakowanie komórek Raji niebieskim znacznikiem komórek (CMAC, wzbudzenie UV i emisja niebieska) odróżnia je od komórek Th, gdy tworzone są koniugaty synaptyczne. Barwnik ten jest kompatybilny z utrwalaczami PFA i acetonu i umożliwia dalsze zabiegi immunofluorescencyjne. Staraj się unikać ekspozycji na światło. Znakowanie komórek Raji w puli za pomocą CMAC, a następnie ponowne zawieszenie przed przyklejeniem komórek Raji do szkiełek komory pokrytych fibronektyną zapewnia jednorodne znakowanie komórek Raji za pomocą CMAC w różnych studzienkach.
- Ponownie zawiesić komórki barwione CMAC i, po aspiracji PBS w szkiełku komorowym z kroku 1.2, przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki szkiełek komorowych pokrytych fibronektyną przygotowanych w krokach 1.1-1.2. Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min-1 h.
UWAGA: Na tym etapie adhezja i etykietowanie CMAC nastąpią jednocześnie, co pozwala zaoszczędzić czas. Należy pamiętać, że komórki Raji szybko się osadzają i należy zachować ostrożność, aby utrzymać jednorodne stężenie w zawiesinie komórkowej przed wysiewem. Na tym etapie nie jest konieczne przemywanie CMAC przez wirowanie, ponieważ mycie CMAC będzie łatwiejsze w kroku 2.7 (gdy oznakowane komórki Raji już przylgnęły do szkiełek komory). Ponieważ CMAC jest obecny w zawiesinie komórek w dużym nadmiarze, niebieskie tło fluorescencji jest zbyt wysokie, aby odróżnić komórki zabarwione na niebiesko. Sprawdź fluorescencję CMAC komórek w kroku 2.7 po umyciu CMAC.
- Upewnij się, że komórki Raji są przyklejone do dna studzienek, delikatnie potrząsając szkiełkami komory na mikroskopie. Upewnij się, że komórki wyświetlają przerwy między sobą i nie są zlewające się (Rysunek 1, środkowy panel). 50-60% zbiegu komórek jest odpowiednie.
- Jeśli większość komórek skutecznie przylega do szkiełka komory i nie zaobserwowano żadnych przerw między komórkami, umyj każdą studzienkę ciepłym, kompletnym podłożem i ponownie zamieszaj pożywkę za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć nadmiar komórek. Sprawdzaj zbieg po każdym etapie ponownego zawieszenia.
- Jeśli komórki nie przylegają do siebie, powtórz ponownie etap adhezji i zwiększ czas adhezji i/lub liczbę komórek.
UWAGA: W tym miejscu można się zatrzymać, inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc (O/N) i kontynuować zgodnie z protokołem następnego dnia. Proszę potwierdzić następnego dnia, że komórki Raji pozostają przylegające i znakowane CMAC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Ponownie dokładnie umyj każdą studzienkę ciepłym dodatkiem RPMI, aby wyeliminować nadmiar CMAC i sprawdź, czy nie ma niebieskiej emisji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (rysunek 1).
UWAGA: Aby uniknąć stosowania olejku immersyjnego (lepkiego i lepkiego) oraz obiektywów olejowych o dużej aperturze numerycznej, można użyć obiektywów o bardzo dużej odległości (tj. 20x lub 40x) do szybkiego sprawdzenia oznakowania CMAC za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
3. Puls CMAC — Znakowane komórki Raji enterotoksyną E gronkowcową
- Dodaj enterotoksynę gronkowcową E (SEE, 1 μg/ml) do każdej studzienki. SEE można wygodnie rozcieńczać w pożywce do hodowli komórkowych (roztwór roboczy o stężeniu 100 μg/ml) z zamrożonych preparatów SEE (1 mg/ml w PBS). Użyj 2 μl 100x roztworu roboczego na 200 μl mikrostudzienki.
UWAGA: Na tym etapie użyj rękawiczek i wyrzuć zużytą końcówkę do pudełka z zagrożeniem biologicznym.
- Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 30 minut. Efekt SEE utrzymuje się przez co najmniej 3-4 godziny.
UWAGA: SEE można dodawać do dołków w różnych punktach czasowych, jeśli jest to wymagane, jeśli planowane są odrębne konfiguracje poklatkowe (krok 5) i/lub w zależności od punktu początkowego eksperymentów z punktem końcowym (krok 6).
4. Przygotowanie komórek Jurkat
- Do tego eksperymentu należy użyć wcześniej wyhodowanej kultury komórek Jurkata (1-2 x 106 komórek/ml). Należy użyć komórek ze standardowej kolby hodowlanej lub z poprzedniej transfekcji zgodnie ze standardowymi protokołami elektroporacji, jak opisano wcześniej. Transfekcja komórek Jurkata pozwoli na poklatkową wizualizację ruchu granulek wydzielniczych w żywych komórkach. Na przykład, gdy GFP-CD63 (marker MVB) ulega ekspresji, można zarejestrować ruch pęcherzyków ozdobionych GFP-CD63.
- Obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Jeśli zaobserwuje się nadmiar martwych komórek (>20-30%), przed użyciem należy przeprowadzić wirowanie w gradiacji gęstości Ficoll przy użyciu standardowych protokołów, aby wyeliminować nadmiar martwych komórek (martwe komórki wykazują większą gęstość niż żywe komórki) (patrz Dyskusja).
- Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, probówki z dnem w kształcie litery V i użyj 10 μl do liczenia za pomocą hemocytometru.
- Odwirować pozostałe komórki zgodnie z opisem w kroku 2.2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w tym samym stężeniu co komórki Raji (1 x 106/ml) przy użyciu świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej. Wykonaj kroki 2.2-2.3.
- Utrzymuj komórki Jurkata w hodowli (37 °C, 5% CO2 ) w oczekiwaniu na Krok 4.
UWAGA: W drugiej opcji (transfekcja) liczba żywych komórek będzie znacznie mniejsza niż w pierwszej. Dlatego rozważ użycie większej początkowej objętości hodowli komórkowej, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do eksperymentu. Z 10 x 106 komórek Jurkat na kuwetę elektroporacyjną i transfekcję, tylko 2-4 x 106 komórek Jurkat przetrwa po 48 godzinach transfekcji, a niektóre z tych komórek zostaną utracone podczas etapu Ficoll. Tak więc jedna kuweta elektroporacyjna jest na ogół wystarczająca, aby rzucić wyzwanie przylegającym komórkom Raji z impulsem SEE z 8 mikrodołków (potrzebne 1,6 x 106 transfekowanych komórek Jurkat).
5. Współwysiewanie komórek Raji i Jurkat
- Wyjąć z inkubatora szkiełka komorowe zawierające znakowane CMAC, pulsacyjne, sklejone komórki Rajiego z kroku 3.2. Na tym etapie nie jest konieczne mycie CMAC, ponieważ zostało to już zrobione w kroku 2.7.
- Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, jeden po drugim, z jednego rogu studzienki za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl. Nie pozwól, aby podłoże w studni całkowicie wyschło.
- Natychmiast zastąpić pożywkę 200 μl zawieszonych komórek Jurkat w pożywce do hodowli komórkowych (1 x 106/ml) przygotowanej w kroku 4.5. Jeśli wykonywane jest obrazowanie poklatkowe, przejdź do kroku 6 bezpośrednio po tym kroku, ponieważ komórki Jurkata mają tendencję do osadzania się i bardzo szybkiego tworzenia koniugatów synaptycznych. Dla wygody, mikrostudzienki zawierające pulsacyjne, przylegające komórki Raji SEE, które na tym etapie nie otrzymują wysiewu komórkami Jurkat, powinny być utrzymywane z pożywką do hodowli komórkowych do czasu późniejszego wyzwania komórkami Jurkat. Pozwoli to na elastyczne podejmowanie kolejnych wyzwań z komórkami Jurkat w celu uzyskania dodatkowych podejść eksperymentalnych poklatkowych lub odwróconych kinetycznie w punktach końcowych.
- Jeśli ma zostać wykonany film poklatkowy, szybko przejdź do kroku 6. Polega to na kohodowli przez 1-2 godziny w inkubatorze mikroskopowym lub równoważnym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić tworzenie koniugatu synaptycznego i jednoczesną akwizycję obrazu. Jeśli przewiduje się analizę punktu końcowego, ale nie przewiduje się upływu czasu, sprawdź tworzenie koniugatu po okresie wspólnej hodowli za pomocą mikroskopu (jak na rysunku 1) przed utrwaleniem komórek.
6. Obrazowanie poklatkowe pojawiających się koniugatów synaptycznych
- Przygotuj mikroskop i komorę inkubacyjną przed obrazowaniem. Dla przykładu szczegółowe ustawienia mikroskopii pokazano na rysunku 2.
UWAGA: Jeśli planowany jest eksperyment poklatkowy, wszystkie ustawienia mikroskopu i uzupełnienia (komora do hodowli komórek otoczenia itp.) powinny być przygotowane przed dodaniem zawiesiny Jurkat do szkiełka komorowego z przylegającymi komórkami Raji. Poniższe kroki są opisane dla mikroskopu komercyjnego (tabela materiałów). Można jednak użyć dowolnego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w inkubator do hodowli komórkowych.
- Do obrazowania ruchu spolaryzowanego używaj mikroskopu z 60-krotnym zanurzeniem w oleju i dużą aperturą numeryczną.
- Upewnij się, że system automatycznego ustawiania ostrości jest włączony i dostosuj przesunięcie, aby ustawić ostrość komórek Raji związanych z dolną powierzchnią. Proszę zapoznać się z rysunkiem 1.
- Po dodaniu Jurkata do każdej studzienki zawierającej przylegające komórki Raji w kroku 5.3, szybko zlokalizuj szkiełko komory mikrostudzienki na wstępnie podgrzanym (1-2 h) inkubatorze mikroskopowym (tj. OKOlab) i wybierz kilka pozycji XY za pomocą mikroskopu, pól, w których prawdopodobnie zarejestruje powstającą formację IS, utworzoną przez, na przykład, komórkę transfekowaną Jurkatem, która wpadnie w ognisko mikroskopu.
- Użyj wstępnie podgrzanego inkubatora mikroskopowego, ponieważ zaobserwowano, że stolik stabilizowany temperaturowo utrzymuje stabilne pozycje X, Y, Z. Kryteriami dla wygodnego pola XY są: dobrze skoncentrowane i niezlewające się komórki Raji (tj. wykazujące przerwy między komórkami) oraz obecność transfekowanych komórek Jurkata (można to sprawdzić, łącząc kanały transmitancji i UV lub GFP). Komórki Jurkata bardzo szybko (kilka minut) osadzają się na szkiełku komorowym, a szanse na zobrazowanie powstających synaps będą się zmniejszać z czasem (ryc. 1). Możliwe jest zakończenie eksperymentu po upływie określonego czasu poklatkowego lub przejście do Kroku 7 i ustalenie koniugatów do późniejszej immunofluorescencji i analiz.
UWAGA: Możliwe jest wybranie do 16 różnych pól mikroskopowych z maksymalnie 4 różnych mikrodołków w celu jednoczesnej, wielodołkowej akwizycji poklatkowej z odpowiednią rozdzielczością czasową (1-2 minuty na klatkę). Ograniczenie opiera się zarówno na liczbie, jak i intensywności (wpływającej na ekspozycję kamery) różnych fluorochromów, które mają być obrazowane (w zależności od liczby eksprymowanych białek fluorescencyjnych, z wyjątkiem CMAC). Jednym ze sposobów na zwiększenie liczby klatek na sekundę jest nagrywanie dla kanału CMAC tylko w jednym z każdych "n" przedziałów czasowych dla GFP (tj. n = 8, jak pokazano na rysunku 2), ponieważ komórki Rajiego są przylegające do dna studni i nie poruszają się łatwo jak komórki Jurkata. Ponadto korzystnie wpływa to na żywotność komórek, ponieważ częsta ekspozycja na światło UV może je uszkodzić. Spróbuj dostosować liczbę klatek na sekundę do 1 klatki co 1 minutę lub krócej (tj. 20 s na klatkę, Rysunek 2), ponieważ polaryzacja MVB trwa od kilku minut do godzin. Do przeprowadzenia tego wielokanałowego przechwytywania niezbędny jest mikroskop wyposażony w zmotoryzowaną wieżyczkę epifluorescencyjną i odpowiednie pasmowo-przepustowe filtry fluorescencyjne lub ich odpowiedniki.
