Rozpoznawanie markerów CD ludzkich komórek zabójczych indukowanych cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Hsiao, C. H., et al. Izolacja i ekspansja cytotoksycznych komórek T indukowanych cytokinami do leczenia raka. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy technikę opartą na cytometrii przepływowej, aby określić proporcję indukowanych przez cytokiny limfocytów T, komórek CIK, rozwiniętych z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Wprowadzenie i rozbudowa CIK

1. W dniu 0 hodować PBMC (1 x 10⁶) w świeżej pożywce podstawowej zawierającej 1 000 j.m./ml IFN-γ przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. W dniu 1 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 50 ng/ml przeciwciała anty-CD3, 1 ng/ml rh IL-1α i 1,000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj podłoże co 3 dni.
3. W dniu 7 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 1 000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj pożywkę co 3 dni, aż do końca ekspansji komórek (dzień 14).

2. Immunofenotypowanie do oceny komórek CIK

1. Umyj komórki CIK 10 ml sterylnego PBS. Wirować przez 10 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 18−20 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki 10 ml PBS. Policz liczbę komórek i zbadaj żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.
2. Podziel komórki CIK na sześć sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml o gęstości ~5–10 x 10⁵ komórek/ml PBS. Oznaczyć i traktować w następujący sposób: Probówka 1, ślepa (bez przeciwciał); Probówkę 2 dodać 20 μl izotypu IgG1-FITC; Probówka 3, dodać 20 μl izotypu IgG1-APC mAbs; Probówka 4, dodać 20 μl CD3-FITC; Probówka 5, dodać 20 μl mAb CD56-APC; i probówkę 6, dodaj 20 μl CD3-FITC i 20 μl mAb CD56-APC.
3. Delikatnie wymieszaj komórki CIK z przeciwciałami, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą o pojemności 1 ml, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Odwirować probówki przez 10 minut przy 300 x g i temperaturze 18−20 °C. Odessać supernatant i zawiesić jednokrotnie osad komórkowy w 1 ml PBS. Delikatnie pipetuj je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą o pojemności 1 ml.
5. Powtórz krok 2.4.
6. Pozostaw probówki w ciemności przed analizą cytometrii przepływowej.

3. Rozpoznawanie znaczników CD

1. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu z nasadką sitkową (siatka 100 μm), delikatnie pipetując przez nasadkę. Ułóż rurki na karuzeli w kolejności.
2. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i utwórz folder eksperymentalny. Kliknij przycisk Nowa próbka, aby dodać próbkę i probówkę do eksperymentu i nazwij probówki w następujący sposób: Probówka 1, Pusta; Rurka 2, izotyp IgG1-CD3; Rurka 3, Izotyp IgG1-CD56; Rurka 4, CD3; Rurka 5, CD56; Rura 6, CD3CD56.
3. Utwórz system bramkowania rozproszonego dla populacji komórek CIK (rysunek 1A).
   1. Wybierz Rura 1 (Pusta) i kliknij przycisk Wykres punktowy, aby utworzyć wykres FSC-A/SSC-A. Narysuj prostokątną bramkę na całej populacji komórek z progiem FSC-A >5 x 10⁴, aby wykluczyć resztki komórek.
   2. Wybierz parametr SSC-A/SSC-H dla nowego wykresu punktowego i narysuj bramkę wielokątów wokół wszystkich pojedynczych komórek. Wybierz odpowiednio parametry Count/FITC (CD3) i Count/APC (CD56) dla nowego wykresu histogramu. Wybierz parametr FITC (CD3)/APC (CD56) dla nowego wykresu kropkowego i narysuj bramkę czterokwadrantową, aby zdefiniować cztery subpopulacje.
   3. Rejestruj dane z 20 000 pojedynczych komórek w każdej próbce. Kliknij przycisk Załaduj próbkę, aby najpierw przeanalizować próbkę kontrolną pustą. Zidentyfikuj całą populację komórek CIK przy użyciu parametrów kanału CD56 i CD3.
4. Powtórzyć krok 3.3 w celu zbadania wszystkich próbek.
5. Otwórz pliki zawierające wartości statystyczne poszczególnych próbek, aby przeanalizować populacje komórek CIK i wydrukuj je ponownie w plikach analizy.

Wyniki

Rysunek 1: Proporcja limfocytów T CD3 ⁺ CD56 ⁺ z reprezentatywnej próbki PBMC.(A) Limfocyty rozpoznano na podstawie określonej wielkości i ziarnistości. Wybrana populacja pojedynczych komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej. (B) Analizę statystyczną skuteczności ekspansji CIK u trzech zdrowych dawców przeprowadzono za pomocą testu t (*, p < 0,01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-ludzkie CD56 APC	Bd	555518	Zobacz materiał B159
Mysz APC IgG1, kontrola izotypu κ	Bd	555751	MOPC-21 (wersja
Cytometr przepływowy BD FACSCanto II	Bd	338962	Numer Seryjny: R33896202856
Zmodyfikowany Dulbecco Eagle Medium/F12	Klon HyClone	SH30023.02	Pożywka podstawowa do hodowli komórek OC-3
Surowica bydlęca płodu	Klon HyClone	SH30084.03	Do hodowli komórkowych K562 i OC-3. Kompletna pożywka zawiera 10% FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	71101700-EK	Rozwiązanie gradientu gęstości
Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD3 FITC	Bd	555332	UCHT1
Mysz FITC IgG1, kontrola izotypu κ	Bd	555748	MOPC-21 (wersja
Ludzki przeciwciała anty-CD3	Takara	Zobacz materiał T210	OKT3 Dodaj 2,5 ml bulionu (1 mg/1 ml) do 50 ml pożywki indukcyjnej. Zapas magazynowy w temperaturze -80 °C
RPMI1640 średni	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11875-085	Pożywka podstawowa do hodowli komórek K562. Zapas magazynowy w temperaturze 4 °C

angielska) powiedział: angielska)