$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Wprowadzenie i rozbudowa CIK
- W dniu 0 hodować PBMC (1 x 106) w świeżej pożywce podstawowej zawierającej 1 000 j.m./ml IFN-γ przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- W dniu 1 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 50 ng/ml przeciwciała anty-CD3, 1 ng/ml rh IL-1α i 1,000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj podłoże co 3 dni.
- W dniu 7 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 1 000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj pożywkę co 3 dni, aż do końca ekspansji komórek (dzień 14).
2. Immunofenotypowanie do oceny komórek CIK
- Umyj komórki CIK 10 ml sterylnego PBS. Wirować przez 10 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 18−20 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki 10 ml PBS. Policz liczbę komórek i zbadaj żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.
- Podziel komórki CIK na sześć sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml o gęstości ~5–10 x 105 komórek/ml PBS. Oznaczyć i traktować w następujący sposób: Probówka 1, ślepa (bez przeciwciał); Probówkę 2 dodać 20 μl izotypu IgG1-FITC; Probówka 3, dodać 20 μl izotypu IgG1-APC mAbs; Probówka 4, dodać 20 μl CD3-FITC; Probówka 5, dodać 20 μl mAb CD56-APC; i probówkę 6, dodaj 20 μl CD3-FITC i 20 μl mAb CD56-APC.
- Delikatnie wymieszaj komórki CIK z przeciwciałami, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą o pojemności 1 ml, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odwirować probówki przez 10 minut przy 300 x g i temperaturze 18−20 °C. Odessać supernatant i zawiesić jednokrotnie osad komórkowy w 1 ml PBS. Delikatnie pipetuj je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą o pojemności 1 ml.
- Powtórz krok 2.4.
- Pozostaw probówki w ciemności przed analizą cytometrii przepływowej.
3. Rozpoznawanie znaczników CD
- Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu z nasadką sitkową (siatka 100 μm), delikatnie pipetując przez nasadkę. Ułóż rurki na karuzeli w kolejności.
- Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i utwórz folder eksperymentalny. Kliknij przycisk Nowa próbka, aby dodać próbkę i probówkę do eksperymentu i nazwij probówki w następujący sposób: Probówka 1, Pusta; Rurka 2, izotyp IgG1-CD3; Rurka 3, Izotyp IgG1-CD56; Rurka 4, CD3; Rurka 5, CD56; Rura 6, CD3CD56.
- Utwórz system bramkowania rozproszonego dla populacji komórek CIK (rysunek 1A).
- Wybierz Rura 1 (Pusta) i kliknij przycisk Wykres punktowy, aby utworzyć wykres FSC-A/SSC-A. Narysuj prostokątną bramkę na całej populacji komórek z progiem FSC-A >5 x 104, aby wykluczyć resztki komórek.
- Wybierz parametr SSC-A/SSC-H dla nowego wykresu punktowego i narysuj bramkę wielokątów wokół wszystkich pojedynczych komórek. Wybierz odpowiednio parametry Count/FITC (CD3) i Count/APC (CD56) dla nowego wykresu histogramu. Wybierz parametr FITC (CD3)/APC (CD56) dla nowego wykresu kropkowego i narysuj bramkę czterokwadrantową, aby zdefiniować cztery subpopulacje.
- Rejestruj dane z 20 000 pojedynczych komórek w każdej próbce. Kliknij przycisk Załaduj próbkę, aby najpierw przeanalizować próbkę kontrolną pustą. Zidentyfikuj całą populację komórek CIK przy użyciu parametrów kanału CD56 i CD3.
- Powtórzyć krok 3.3 w celu zbadania wszystkich próbek.
- Otwórz pliki zawierające wartości statystyczne poszczególnych próbek, aby przeanalizować populacje komórek CIK i wydrukuj je ponownie w plikach analizy.
