Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Adoptywny transfer antygenowych limfocytów T CD8+ u myszy
- Wyizoluj specyficzne dla albuminy jaja kurzego (OVA) limfocyty T CD8 + (OTI) eksprymujące białko zielonej fluorescencji (OTI-GFP) lub białko czerwonej fluorescencji (OTI-RFP) z zawiesiny węzłów chłonnych transgenicznych myszy z receptorem komórek T za pomocą mysiego zestawu do izolacji limfocytów T CD8 + zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować zawiesinę komórkową, rozbijając węzły chłonne za pomocą tłoka strzykawki, jak opisano wcześniej.
- Przenieś komórki OTI-GFP lub OTI-RFP (3 x 106 komórek) do biorców myszy typu dzikiego C57BL / 6 przez wstrzyknięcie dożylne, jak opisano Cahalan i wsp. Użyj myszy, które zwykle mają 6-12 tygodni.
nuta: Ten krok jest opcjonalny i wymagany tylko do śledzenia limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.
2. Zakażenie Listeria monocytogenes
- Rozwiń L. monocytogenes genetycznie zmodyfikowany do ekspresji OVA (LM-OVA) do wykładniczej fazy wzrostu w bulionie naparu serca w temperaturze 37 °C przy delikatnym mieszaniu, aż OD600 osiągnie 0,08–0,1, jak opisano wcześniej.
- Wstrzyknąć 100 μl (maksymalna objętość = 200 μL) 0,1–0,5 LD50 LM-OVA rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez wstrzyknięcie dożylne za pomocą strzykawki insulinowej 29 G, biorcom myszy typu dzikiego C57BL/6 z komórkami OTI-GFP lub OTI-RFP, jeśli jest to wskazane.
nuta: W naszych rękach 0,1 x LD50 LM-OVA odpowiada 2 x 104 jednostkom tworzącym kolonie (CFU). L. monocytogenes genetycznie zmodyfikowany do ekspresji OVA służy do aktywacji wcześniej przeniesionych limfocytów T OTI CD8 +, ale można zastosować inne szczepy L. monocytogenes.
3. Leczenie Brefeldiną A (BFA) w celu zablokowania wydzielania cytokin
- Wstrzyknąć 250 μg BFA do 200 μl PBS dootrzewnowo przez 6 godzin przed uśmierceniem myszy za pomocą strzykawki insulinowej 29 G.
nuta: Liofilizowany BFA jest najpierw ponownie zawieszany w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu przygotowania zapasu o stężeniu 25 mg / ml. BFA jest następnie rozcieńczany w PBS w temperaturze pokojowej (RT), aby uniknąć krystalizacji przed wstrzyknięciem. Hamowanie wydzielania cytokin indukuje akumulację IFNγ w komórkach. Ma to kluczowe znaczenie dla wykrywania cytokin.
4. Zbieranie śledziony
- Poddaj myszy eutanazji za pomocą rosnących stężeń CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
nuta: Postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnej instytucji dotyczącymi humanitarnej eutanazji myszy.
- Oczyść brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie nożyczkami, aby wykonać 1-2 cm nacięcie przez skórę po lewej stronie myszy, gdzie znajduje się śledziona. Ostrożnie wykonaj nacięcie w otrzewnej, aby odsłonić śledzionę i wyjmij ją pęsetą. Zbierz śledzionę, uważając, aby nie ściskać jej kleszczami ani nie przecinać, aby nie zakłócić architektury śledziony.
5. Utrwalenie śledziony za pomocą paraformaldehydu (PFA)
- Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 3,75 ml PBS i 3,75 ml 0,2 M L-lizyny. Dodać 21 mg m-periodyanu sodu i dobrze wymieszać. Następnie dodać 2,5 ml 4% PFA i 20 μl 12 N NaOH.
nuta: Użyj roztworu utrwalającego tego samego dnia i wyrzuć nadmiar. Nie przechowuj go. Ten etap utrwalenia jest ważny, jeśli próbka zawiera białka fluorescencyjne, takie jak GFP. Nie należy stosować PFA zawierającego śladowe ilości metanolu, ponieważ denaturuje on białka fluorescencyjne.
ostrożność: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
- Zanurz śledzionę w utrwalaczu i utrwalaj przez co najmniej 4 godziny, zwykle 16–20 godzin w temperaturze 4°C pod delikatnym mieszaniem.
- Odrzucić roztwór utrwalający i dodawać 5 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
- Zastąpić PBS 5 ml świeżego PBS i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu.
- Zastąp PBS 5 ml 30% sacharozy i inkubuj przez 12–24 h.
nuta: Metoda ta pomaga w utrzymaniu morfologii tkanek. Po inkubacji z roztworem sacharozy narząd powinien opaść na dnie studni.
6. Zamrażanie i dzielenie na sekcje
- Umieść suchy lód w dużym pojemniku i umieść w nim mniejszy pojemnik zawierający około 50 ml czystego metanolu i kilka kawałków suchego lodu.
- Delikatnie osusz śledzionę niestrzępiącą się chusteczką.
- Umieść śledzionę w formie bazowej zawierającej kroplę związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na dnie. Uważaj, aby nie wytworzyć żadnych bąbelków. Dodaj OCT na śledzionę.
- Za pomocą kleszczy umieść formę bazową na powierzchni metanolu, upewniając się, że nie dotyka OCT. Zamroź tkankę tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować artefakty.
- Po zamrożeniu kontynuuj sekcjonowanie.
nuta: Zamrożoną śledzionę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
- Przeciąć tkankę za pomocą kriomikrotomu.
- Ustaw temperaturę komory na kriostacie na -21 °C. Wytnij odcinki o żądanej grubości (zwykle około 10 μm). Protokół ten działa przy grubościach do 30 μm.
- Pobrać skrawki na szklane szkiełka mikroskopowe (patrz Tabela materiałów) i sprawdzić wzrokowo.
nuta: Sekcje mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
7. Barwienie immunofluorescencyjne
- Zezwól sekcji na przejście do RT.
- Narysuj okrąg za pomocą blokera płynów (np. pisaka PAP) wokół sekcji tkanki. Narysuj poza OCT, albo się nie przyklei.
- Po wyschnięciu należy ponownie nawodnić próbkę, umieszczając PBS na przekroju tkanki na 5 min.
nuta: Objętość umieszczona na sekcji zależy od wielkości sekcji. Zazwyczaj używamy 100–300 μl. Nie pozwól, aby sekcje wyschły po ich ponownym nawodnieniu.
- Spłukać PBS co najmniej dwa razy, aby upewnić się, że sekcja jest dobrze przylegająca do szkiełka.
- Dodaj roztwór blokujący do sekcji, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
- Przygotować roztwór blokujący w następujący sposób: PBS z 0,1% Triton X100, 2% płodowa surowica cielęca (FCS), 2,5 μg/ml bloker receptora Fc (anty-mysz CD16/32). Następnie dodać 2-5% normalnej surowicy gatunków każdego przeciwciała drugorzędowego panelu barwienia.
nuta: Jeśli przeciwciała są bezpośrednio sprzężone/biotynylowane, dodać 5% normalnej surowicy gatunków każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe i jedno z przeciwciał drugorzędowych pochodzą od tego samego gatunku (np. przeciwciało pierwszorzędowe wyhodowane u królika i przeciwciało drugorzędowe u królika i przeciwciało drugorzędowe u szczura), nie należy stosować normalnych gatunków surowicy, ponieważ zwiększy to sygnał tła.
- Delikatnie usunąć PBS z przekroju przez aspirację i dodać 100 μl roztworu blokującego na sekcję próbki. Inkubować w mokrej komorze pod przykryciem przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Barwienie przeciwciałami pierwotnymi.
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w optymalnym stężeniu w roztworze blokującym. Ogólne stężenie przeciwciał w punkcie wyjściowym wynosi 5 μg/ml, ale powinno być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała i tkanki.
nuta: Jeżeli przeciwciała są bezpośrednio sprzężone, przed użyciem odwirować mieszaninę przeciwciał w temperaturze 17.135 x g (13.500 obr./min) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Fluorofory mogą się wytrącać. Ten krok spowoduje osady, a tym samym zapobiegnie niespecyficznemu osadzaniu się wytrąconych przeciwciał na szkiełku.
- Zastąp roztwór blokujący pierwszorzędową mieszanką przeciwciał dla każdej próbki.
- Inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc (OVN) w temperaturze 4 °C w zakrytej mokrej komorze.
- Wykonaj pranie.
- Przygotuj bufor do płukania, dodając 2% FCS do PBS.
- Przemyć 4 razy buforem do płukania: jeden szybki (bez inkubacji), jeden przez 10 minut i dwa przez 5 minut. Następnie wykonaj końcowe płukanie PBS przez 5 minut.
- Barwienie przeciwciałami wtórnymi.
- Rozcieńczyć badane przeciwciała drugorzędowe w optymalnym stężeniu w roztworze blokującym. Odwirować mieszaninę, zgodnie z opisem dla przeciwciał pierwszorzędowych.
- Usuń końcowy roztwór myjący. Dodać mieszaninę przeciwciał drugorzędowych na wierzch sekcji i inkubować przez 1–4 godziny w temperaturze pokojowej w zakrytej mokrej komorze.
- Przemyć 4 razy buforem do płukania: jeden szybki (bez inkubacji), jeden przez 10 minut i dwa przez 5 minut. Następnie wykonaj końcowe płukanie PBS przez 5 minut.
- Usuń końcowy roztwór myjący. Pozwól, aby PBS odparował, ale nie przesuszaj sekcji. Umieść kroplę podłoża montażowego na wierzchu próbki i ostrożnie umieść na niej szkło nakrywkowe. Medium montażowe musi odzyskać cały przekrój. Niech polimeraza OVN w RT chroniona przed światłem.
nuta: Narysuj okrąg wokół sekcji po odwrotnej stronie szkiełka przed nałożeniem medium montażowego. Po nałożeniu podłoża mocującego tkanka może stać się trudna do zauważenia.
- Przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do obrazowania.
8. Obrazowanie i analiza
- Wykonaj obrazowanie barwienia za pomocą mikroskopu konfokalnego.
nuta: W tym protokole zastosowano odwrócony spektralny laserowy mikroskop skaningowy (patrz tabela materiałów) wraz z obiektywami 10x/NA 0,40 lub 60x/NA 1,4 (do analizy lokalizacji subkomórkowej cytokin). Długości fal wzbudzenia i emisji są wyświetlane dla każdego fluoroforu i białka fluorescencyjnego w tabeli materiałów.
- W razie potrzeby wykonuj analizę i kwantyfikację za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. Imaris lub Fiji).
