Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Oczyszczanie płytek krwi
UWAGA: Oczyszczanie płytek krwi powinno odbywać się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec ich degradacji. Upewnij się, że temperatura odczynników i narzędzi wynosi od 18 do 22 °C. Aby zapobiec degradacji płytek krwi, podczas zabiegu należy unikać szybkiego pipetowania i energicznego potrząsania.
- Dodać 600 μl pożywki gradientowej joheksolu (12% proszku joheksolu w 0,85% chlorku sodu, 5 mM trycyny, pH 7,2) do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Powoli dodać 200 μl próbki krwi po boku probówki na wierzch gradientowego podłoża z końcówką pipety o szerokim otworze, tak aby krew i pożywka joheksolu nie mieszały się (ryc. 1A).
- Odwirować probówkę zawierającą próbkę o masie 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem.
- Zebrać większość warstwy bogatopłytkowej i niewielką część warstwy ubogiej w płytki krwi (łącznie 300 do 400 μl) za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, nie naruszając warstw RBC i WBC (ryc. 1B). Przenieść próbkę płytek krwi do nowej probówki.
nuta: Jeśli liczba płytek krwi we krwi jest mniejsza lub używana jest mniejsza objętość krwi, warstwa bogatopłytkowa i warstwa uboga w płytki krwi mogą być postrzegane jako pojedyncza warstwa.
- Dodać 1 ml PBS do próbki płytek krwi, wymieszać przez odwrócenie i odwirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Całkowicie odrzucić roztwór i dodać 200 μl PBS w celu ponownego zawieszenia płytek krwi za pomocą łagodnego pipetowania.
nuta: Ten etap jest opcjonalny, ponieważ usuwa pożywkę gradientową i białka osocza oraz zwiększa wrażliwość płytek krwi na agonistów, takich jak trombina. Ponieważ różne wirówki mają różne programy, powolne przyspieszanie/zwalnianie można określić, czytając instrukcję obsługi wirówki.
- Przenieść 30 μl tej próbki do nowej probówki w celu policzenia płytek krwi. Pozostałe płytki krwi można wykorzystać do testów biochemicznych i fizjologicznych, takich jak aktywacja płytek krwi, agregacja, uwalnianie granulek itp.
- W celu ekstrakcji RNA lub białka odwirować próbkę płytek krwi o masie 800 x g przez 10 minut w celu osadzenia płytek krwi. Całkowicie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Dodaj żądaną objętość RNA lub buforu do lizy białek, aby zlizować płytki krwi.
2. Aktywacja płytek krwi
- W probówce dodać od 1 do 2 milionów oczyszczonych płytek krwi w objętości do 100 μl buforu barwiącego (PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą, FBS).
- Dla wielokrotnej liczby próbek należy wykonać główną mieszaninę przeciwciał z 1 μl (0,5 mg/ml) następujących składników: PE-Cy7 anty-mysie TER 119, PE szczur anty-mysi CD45, FITC szczur anty-mysz CD41 i APC szczur anty-mysz/ludzka CD62P (selektyna P) w celu wykrycia odpowiednio RBC, WBC, płytek krwi i aktywowanych płytek krwi. Dodaj mieszankę wzorcową do probówek w celu zabarwienia komórek. Nie należy dodawać trombiny.
- W innej probówce dodaj od 1 do 2 milionów oczyszczonych płytek krwi w objętości do 100 μl buforu barwiącego i 0,4 mM peptydu GPRP. Dodaj trombinę, aby aktywować płytki krwi i wybarwić komórki zgodnie z krokiem 2.2.
nuta: GPRP należy dodać do próbki przed dodaniem trombiny, aby zapobiec tworzeniu się agregatów lub skrzepów poprzez aktywację płytek krwi. Stężenie trombiny powinno być zoptymalizowane, aby uzyskać dobrą aktywację płytek krwi. Po aktywacji płytek krwi liczba zdarzeń jest zmniejszana podczas pobierania próbek za pomocą cytometrii przepływowej.
- Jako kontrolę pozytywną dodać 1 μl krwi pełnej do 100 μl buforu barwiącego w probówce i 0,4 mM peptydu GPRP. Dodaj trombinę, aby aktywować płytki krwi. Jako kontrolę ujemną dodać 1 μl krwi pełnej do 100 μl buforu barwiącego. Nie dodawać trombiny do ujemnej próbki kontrolnej. Wybarwić komórki zgodnie z krokiem 2.2.
- W celu kontroli izotypu cytometrii przepływowej oznacz 5 probówek niebarwionym, PE-Cy7, PE, FITC i APC. Dodać 100 μl buforu barwiącego, 1 μl krwi i 1 μl odpowiedniego przeciwciała do znakowanych probówek, aby wybarwić komórki.
- Inkubować próbki do barwienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Przemyć próbki, dodając 1 ml buforu barwiącego do każdej probówki. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzuć bufor barwiący, nie usuwając osadu.
- Dodać 300 μl buforu barwiącego do każdej probówki, delikatnie wymieszać i przenieść do probówki FACS. Zabarwione próbki należy przechowywać w ciemności do czasu analizy za pomocą cytometru przepływowego.
