Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie pożywki, roztworów enzymatycznych i zwierząt
- Przygotuj 1% alkoholu jodowego, rozpuszczając 1 g jodu w 100 ml etanolu.
- Przygotować 2x 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) firmy Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+ uzupełnionych każdym o 7,5 ml D-glukozy (100 g / L) i 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/streptomycyny (15 mg / ml D-glukozy, 50 U / ml penicyliny i 50 μg / ml Streptomycyny końcowej).
- Suplement 1x 500 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 5 ml 100x roztwór podstawowy penicyliny/streptomycyny (50 j./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny końcowej).
- Przygotować roztwór trypsyny-DNazy I (2,5 mg/ml trypsyny i 10 μg/ml DNazy I), dodając 25 mg trypsyny i 0,1 ml DNazy I (1 mg/ml DNazy I) do 9,9 ml PBS.
- Rozpuścić 50 mg inhibitora trypsyny w 5 ml PBS dla roztworu inhibitora trypsyny A (10 mg/ml). Rozpuścić 25 mg inhibitora trypsyny w 10 ml PBS dla roztworu inhibitora trypsyny B (2,5 mg/ml).
- W przypadku roztworu kolagenazy-hialuronidazy-dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) rozpuścić 10 mg kolagenazy A (1 mg/ml finał), 10 mg hialuronidazy (1 mg/ml finału) i 0,1 ml DNazy I (1 mg/ml DNazy I) (10 μg/ml finału) w 10 ml PBS.
- Przygotować roztwór hialuronidazy-DNazy I, dodając 10 mg hialuronidazy (1 mg/ml ostateczny) i 0,1 ml roztworu DNazy I (1 mg/ml) (10 μg/ml końcowy) do 9,9 ml PBS.
- Zamów szczury Wistar na czas, tak aby w dniu izolacji komórek Sertoliego miały 19 dni.
nuta: Opisany protokół jest przeznaczony dla 10 szczurów, ale może być zmodyfikowany dla minimum 5 i maksimum 20 szczurów. Objętości wszystkich roztworów muszą być odpowiednio dostosowane.
W poniższym protokole "pipeta" oznacza pipetę serologiczną.
2. Przygotowanie kanalików nasiennych
- Znieczulij 10 samców szczurów rasy Wistar jeden po drugim w eksykatorze przy użyciu CO2 i natężenia przepływu, które przemieszcza co najmniej 20% objętości komory na minutę. Poczekaj, aż oddech przestanie oddychać, przetestuj znieczulenie, ściskając poduszkę stopy, a jeśli nie ma reakcji, poddaj każdego szczura eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Odcedź krew, przecinając żyłę szyjną i tętnicę szyjną (vagina carotica) pod płynącą wodą. Zdezynfekuj brzuch, przecierając go 70% etanolem.
- Za pomocą kleszczy podnieś skórę z mięśni brzucha i wytnij owalny płat skóry, który rozciąga się od spojenia łonowego do mostka (ryc. 1A) i przesuń go w górę na klatkę piersiową. Następnie chwyć mięśnie brzucha i wykonaj przyśrodkowe nacięcie od spojenia łonowego do mostka.
- Ściśnij brzuch kciukami od miednicy do góry, aby wypchnąć jądra z dolnej części miednicy. Wybierz poduszeczkę tłuszczową najądrza (ryc. 1B) za pomocą kleszczy, aby podciągnąć jądro dalej. Przeciąć powrózek nasienny (ryc. 1B), pozostawiając osłonkę białawą nienaruszoną, i zebrać wszystkie jądra w 20 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (ryc. 1C).
- Po zebraniu wszystkich jąder zdezynfekuj je, dodając równą objętość (20 ml) 1% (w/v) jodu w etanolu. Odwrócić probówkę dwukrotnie i natychmiast zdekantować supernatant. Szybko przemyj jądra dwukrotnie po 25 ml PBS każde (ryc. 1D).
- Przenieść jądra na szalkę Petriego zawierającą 15 ml PBS (ryc. 1E). Chwyć mocno każde jądro kleszczami na jednym końcu, wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na przeciwległym końcu i wyciśnij kanaliki za pomocą zamkniętych ostrzy nożyczek jako narzędzia do skrobania.
nuta: Kanaliki powinny nadal tworzyć zwarty wiązkę w kształcie jądra, z zaledwie kilkoma kanalikami rozciągającymi się w roztwór, aby umożliwić jednorodne trawienie enzymatyczne (ryc. 1F).
- Przenieść pozbawione kapsułki jądra do 100 ml butelki z zakrętką zawierającej 10 ml roztworu trypsyny-DNazy I. Trawienie przeprowadzić w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min). Po 4 minutach oceń kanaliki gołym okiem pod kątem dyspersji kanalików. Gdy kanaliki zaczną rozpraszać się w roztworze, natychmiast przerwij trawienie. W razie potrzeby kontynuować inkubację do 2 minut.
- Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając 5 ml roztworu inhibitora trypsyny A. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 3-4 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieś go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Po 5 minutach inkubacji obserwować, jak kanaliki osiadają pod wpływem jednostkowej grawitacji, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml z kroku 2.6 i dodać 10 ml roztworu inhibitora trypsyny B w celu całkowitego zatrzymania trawienia trypsyny. Ponownie zawiesić kanaliki, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
- W celu usunięcia zanieczyszczających komórek śródmiąższowych należy przemyć kanaliki 9 razy po 25 ml PBS każdy. Ponownie zawiesić kanaliki w każdym płukaniu za pomocą pipety o pojemności 25 ml i pozostawić je do ustabilizowania się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 10 minut. Zawsze używaj tej samej pipety o pojemności 25 ml do pipetowania PBS, wysiewu i usuwania supernatantu.
3. Usuwanie/izolacja komórek okołokanalikowych (PTC)
- Przenieś wszystkie kanaliki do butelki z zakrętką o pojemności 100 ml i dodaj roztwór kolagenazy-hialuronidazy-DNazy I (ryc. 2A). Trawienie należy przeprowadzać przez 10 minut w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min).
- Odpipetuj kroplę zawiesiny na szklane szkiełko i szybko sprawdź kanaliki pod mikroskopem światła odwróconego pod kątem rutynowej hodowli komórkowej w 100-krotnym powiększeniu. Jeśli trawienie nie jest wystarczająco zaawansowane, kontynuuj inkubację przez dodatkowe 2 minuty (nie licz czasu potrzebnego na kontrolę mikroskopową).
nuta: Na tym etapie wszystkie kanaliki ulegają skróceniu, a krawędzie kanalików powinny stać się szorstkie (ryc. 2B i C). Ostre krawędzie wskazują na uwalnianie komórek okołokanalikowych.
- Przenieść zawiesinę z wytrawionymi kanalikami do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml z kroku 2.8. Umyj butelkę o pojemności 100 ml 10 ml PBS i dodaj ją do kanalików w stożkowej probówce. Pozostawić strawione kanaliki do ustabilizowania się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant zawierający PTC, ponownie używając pipety o pojemności 25 ml i przenieść go do nowej stożkowej probówki. Do aspiracji ostatnich kilku mililitrów należy użyć pipety o pojemności 5 ml, aby zapobiec przenoszeniu kanalików.
4. Izolacja komórek Sertoliego (SC)
- Ponownie zawiesić osadzone kanaliki z kroku 3.3 dokładnie w 25 ml PBS za pomocą pipety o pojemności 25 ml i pozostawić je do osadzenia się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 12 minut. Użyj tej samej pipety o pojemności 25 ml do pipetowania PBS, ponownego zawieszenia kanalików i usuwania sklarowanych nad osadem. Powtórz pranie 3 razy (w sumie 4 prania).
- Po ostatnim przepłukaniu przełóż strawione kanaliki do kolejnej butelki z nakrętką o pojemności 100 ml zawierającej roztwór hialuronidazy-DNazy I. Trawienie przeprowadzić w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min).
- Po 5 minutach ponownie sprawdź kanaliki za pomocą mikroskopowej kontroli świetlnej przy 100-krotnym powiększeniu, jak opisano w kroku 3.2.
nuta: Krótkie kanaliki, agregaty rurkowe i uwolnione komórki powinny być widoczne (ryc. 2D).
- Pozostawić agregaty rurkowe na 10 minut i odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Przemyć kruszywa 4 razy przy użyciu 25 ml PBS i czasie sedymentacji wynoszącym 10 minut dla każdego etapu płukania (rysunek 2E).
- Dodać 20 ml pożywki RPMI 1640 i przepuścić zawiesinę 10 razy przez igłę 18 G zamontowaną na strzykawce o pojemności 20 ml. Unikaj pęcherzyków powietrza.
nuta: Wciąganie i wysuwanie zawiesiny przez igłę uważa się za jedno przejście. Rozbijanie i homogenizacja komórek przez ścinanie hydrodynamiczne jest standardową techniką przygotowania komórek, które mają tendencję do agregacji. Jest mało prawdopodobne, aby przejście komórek przez igłę podskórną o małej średnicy wewnętrznej miało wpływ na ich właściwości funkcjonalne. Ryciny 3C i D pokazują normalną ultrastrukturę oczyszczonych komórek Sertoliego w 4 dniu hodowli.
- Odpipetować kroplę zawiesiny na szklane szkiełko i szybko sprawdzić kanaliki pod mikroskopem światła odwróconego pod kątem rutynowej hodowli komórek przy 10-krotnym powiększeniu, jeśli wszystkie agregaty są rozproszone (ryc. 2F). Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm w celu uzyskania czystej zawiesiny jednokomórkowej w filtracie.
- Odwirować filtrat z etapu 4.4 przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez użycia przerwy. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 25 ml i ponownie zawiesić komórki Sertoliego w 40 ml pożywki RPMI 1640 (bez surowicy).
- Zmieszać 100 μl zawiesiny komórek ze 100 μl barwienia błękitem trypanowym i policzyć komórki za pomocą komory Neubauer Improved. Dostosuj stężenie komórek do 3 x 106 komórek/ml zgodnie z wynikiem zliczania. Wysiewać 1 ml na dołek na płytce 6-dołkowej (= dzień 1). nuta: Komórki Sertoliego w zawiesinie szybko osiadają, dlatego probówkę należy krótko wstrząsnąć za każdym razem przed pobraniem porcji komórek za pomocą pipety. Do 4 dnia mocno przyczepiają się do podłoża.
