$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja limfocytów T Vδ1
- Weź <1 x 106 izolowanych limfocytów do początkowego FACS określającego częstość limfocytów T Vδ1 CD4.
nuta: Wielkość populacji tej jednostki limfocytów T może się znacznie różnić między osobnikami i w zależności od ich stanu immunologicznego. Zazwyczaj około 1% limfocytów T to Vδ1+, a około 1-5% komórek Vδ1+ to CD4+.
- Rozcieńczyć komórki 1 ml buforu FACS, który składa się z PBS zawierającego 2% FCS i 5 mM EDTA. Wirować przy 660 x g przez 2 minuty i zdekantować supernatant. Objętość refluksu wynosząca około 100 μl buforu FACS jest wystarczająca do późniejszego barwienia. Krótko wirować i inkubować komórki z 5 μl odczynnika blokującego Fc przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu zwiększenia specyficzności barwienia FACS.
- Dodaj ludzkie przeciwciała monoklonalne bezpośrednio do komórek bez usuwania odczynnika blokującego Fc. Upewnij się, że wybarwiłeś komórki przeciwciałami przeciwko Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) i TCRαβ (1:25). Przygotować kontrolę izotypu z odpowiednimi izotypami immunoglobulin. Inkubować komórki z przeciwciałami przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
- Umyć komórki w 1 ml buforu FACS (wirować przez 2 minuty; przy 660 x g), zdekantować supernatant i przystąpić do akwizycji FACS w pozostałej objętości buforu.
- Granulować komórki (które nie są używane w analizie FACS) przez odwirowanie przez 12 minut, w temperaturze 300 g, 8 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w buforze MACS o pojemności 60 μl na 1 x 107 komórek. Dodać 20 μl odczynnika blokującego Fc na 1 x 107 komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4°C.
- Dodać 10 μl sprzężonego z FITC przeciwciała anty-ludzkiego Vδ1 na 1 x 107 komórek bezpośrednio do komórek. Inkubować przez 12 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
- Przemyć komórki za pomocą 14 ml buforu MACS (wirować przez 12 minut; w temperaturze 300 g; 8 °C). Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 80 μl buforze MACS na 1x107 komórek.
- Weź 1-2 x 105 komórek i rozcieńcz je w 100 μl buforu FACS w celu weryfikacji oznakowania za pomocą analizy FACS. Na tym etapie nie są potrzebne żadne dodatkowe dodatki. Upewnij się, że istnieje wystarczająca różnica w jasności dla komórek Vδ1- i Vδ1+. Jeśli tak nie jest, powtórz kroki 1.3 i 1.4.
- Dodać 20 μl mikrogranulek anty-FITC na 1 x 107 komórek do pozostałych komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Następnie przemyć komórki przy użyciu co najmniej 10 ml buforu MACS (wirować przez 12 minut, w temperaturze 300 x g; 8 °C).
- Podczas wirowania należy zrównoważyć wstępnie schłodzoną kolumnę magnetyczną umieszczoną w magnesie z buforem MACS o pojemności 500 μl.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze MACS o pojemności 500 μl (dla komórek o numerach większych niż 1 x 108 należy odpowiednio zwiększyć tę objętość) i ostrożnie nałożyć komórki na kolumnę. Zebrać przepływ zawierający komórki Vδ1-.
- Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu MACS i ponownie zebrać przepływ do tej samej probówki. Należy pamiętać, że zbiornik musi być pusty przed nałożeniem bufora na kolumnę.
- Wyjmij kolumnę z urządzenia magnetycznego i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Szybko przepłukać kolumnę 1 ml buforem MACS, mocno wciskając tłok do kolumny. Zebrać eluat do probówki.
UWAGA: Aby uzyskać czystość >98%, zwykle konieczne jest powtórzenie kroków 1,7-1,9 z drugą kolumną.
- Sprawdzić czystość komórek za pomocą analizy FACS z tym samym panelem przeciwciał co poprzednio (patrz 1.1.2) i policzyć komórki.
2. Izolacja limfocytów T Vδ1CD4+
- Zawiesić 25 μl kulek CD4 za pomocą wiru na >30 sek. Przemyć kulki (minimalna ilość podana przez producenta) w 1 ml buforu MACS w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, umieszczając probówkę w magnesie na 1 min. Supernatant należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety o małej skali (200 μl) i ponownie zawiesić kulki w pierwotnej objętości buforu MACS.
- Granulować komórki Vδ1+ (wirować przez 12 minut; przy 300 x g) i odessać supernatant i ponownie zawiesić wszystkie komórki Vδ1+ w buforze MACS o pojemności 500 μl i dodać je do probówki zawierającej kulki. Mieszać energicznie i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C ze stałym przechylaniem (np. w rotatorze).
- Umieść probówkę zawierającą komórki w magnesie na 2 minuty. Upewnij się, że w pokrywie nie ma żadnych resztek.
UWAGA: Ogniwa CD4+ będą miały związane koraliki magnetyczne i przymocują się do boku rurki skierowanej w stronę magnesu.
- Ostrożnie otwórz pokrywę, trzymając probówkę wewnątrz urządzenia magnetycznego i zbierz supernatant zawierający komórki CD4-Vδ1+ za pomocą małej pipety. Umieść komórki CD4-Vδ1+ w osobnej probówce i ponownie umieść tę rurkę w magnesie, aby uniknąć ewentualnych pozostałych komórek CD4 lub kulek z populacji.
- Umyć komórki CD4 w 5 ml buforu MACS (wirować przez 12 minut; przy 300 x g) i ponownie je zawiesić w stężeniu 1 x 105 komórek na 100 μl pożywki. Komórki CD4 mogą być łatwo hodowane w odpowiednich warunkach.
- Umieść probówkę z celami ogniw CD4+ poza polem magnetycznym, ponownie zawieś ogniwa w buforze MACS o pojemności 500 μl i włóż je z powrotem do urządzenia magnetycznego. Powtórz kroki 2.3-2.5 dwukrotnie, aby uzyskać wyższą czystość. Usunąć supernatant przez pipetowanie.
- Zawiesić komórki CD4+ w 100 μl pożywki hodowlanej (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutamina, 1% penicylina/streptomycyna) i dodać 10 μl roztworu oddzielającego kulki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut ze stałym przechylaniem (np. w rotatorze).
- Umieść komórki w magnesie na 1 minutę. Ostrożnie zbierz supernatant zawierający bezperełkowe komórki Vδ1+CD4+ za pomocą małej pipety.
- Na zewnątrz magnesu ponownie zawiesić kulki za pomocą pożywki hodowlanej 100 μl i powtórzyć kroki 2.6 i 2.7 dwukrotnie, aby uzyskać większą liczbę komórek CD4+.
- Granulować komórki (odwirowywać przy 300 x g, przez 12 minut) i całkowicie odrzucić supernatant przez pipetowanie. Zawieś komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu i policz je. Zbadaj czystość komórek Vδ1 + CD4 + za pomocą analizy FACS przedstawionej w krokach 1.1.1-1.1.3.