Izolacja sieci komórek odpornościowych dziąseł z bloków zębów myszy

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Dutzan, N. et al., Izolacja, charakterystyka i funkcjonalne badanie sieci komórek odpornościowych dziąseł. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje procedurę izolacji sieci komórek odpornościowych dziąseł od modelu mysiego. Trawienie enzymatyczne uwalnia tkankę dziąsła z przyczepionych zębów i kości, która jest dalej trawiona mechanicznie, uwalniając komórki odpornościowe z dziąsła. Wyizolowane komórki są gotowe do eksperymentów immunologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotuj się z wyprzedzeniem

Przygotuj kompletne pożywki: RPMI uzupełnione 2 mM L-glutaminą, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 ug/ml streptomycyny i 10% FBS.
Przygotuj pożywkę DNazy: 50 ml pożywki RPMI uzupełnionej 7,5 μg DNazy (przygotuj świeżość, trzymaj na lodzie przez cały czas).
Przygotuj pożywkę kolagenazy-DNazy: 5 ml pożywki DNazy plus 3,2 mg/ml kolagenazy typu IV (przygotuj świeżość, trzymaj na lodzie przez cały czas).
Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
Inkubator z wytrząsarką ogrzaną do temperatury 37 °C.

2. Izolacja, rozwarstwienie i izolacja komórek z bloków dziąsłowych

Eutanazja myszy poprzez wystawienie ich na działanie CO₂ w odpowiedniej komorze, zgodnie z wytycznymi Komitetu Doradczego ds. Badań na Zwierzętach (ARAC).
Otwórz klatkę piersiową i jamę brzuszną, aby odsłonić serce i narządy wewnętrzne. W celu perfuzji należy wykonać nacięcie w żyle głównej dolnej i przelać 3 ml PBS przez lewą komorę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G.
Unieruchomij ciało i głowę myszy na podkładce z brzuchem skierowanym do góry.
Przetnij nożyczkami każde spoidło wargi w kierunku szyi, oddzielając skórę pokrywającą żuchwę i okolicę szyi oraz odsłaniając leżące poniżej tkanki i mięśnie. Rozetnij dolną wargę, aby odsłonić żuchwę.
Przeciąć między dolnymi siekaczami, aby oddzielić obie strony żuchwy i unieruchomić każdą stronę, aby uzyskać dostęp do jamy ustnej.
Wizualizuj i rozbierz podniebienie z dala od jamy nosowej.
Wypreparuj obszary za pomocą 10 ostrzy i uwzględnij obszary trzonowców szczęki i żuchwy wraz z otaczającym dziąsłem (ryc. 1). Wykonaj pionowe nacięcia tuż przed pierwszym zębem trzonowym i za trzecim trzonem oraz poziome nacięcie na granicy dziąsła (biały kołnierz tkanki otaczającej zęby).
Umieść bloki szczęki i żuchwy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 5 ml kolagenazy/DNazy (przechowywać na lodzie).
Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37°C przez 1 godzinę i podczas ostatnich 5 minut inkubacji dodać 50 μl 0,5 M EDTA.
Dodać 5 ml zimnej pożywki DNazy do probówki o pojemności 50 ml z chusteczkami i delikatnie zamieszać, aby wymieszać.
Przenieś 4 bloki tkanki na szalkę Petriego i przykryj je 500 μl pożywki DNazy. Usuń dziąsło z każdego bloku tkanki, używając ostrza skalpela i kierując ostrze w obszary dziąseł i przestrzeni międzyzębowych.
Przenieść tkanki i pożywkę z płytki Petriego, jak również poprzednie pożywki DNazy używane podczas sekcji, do nowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek (rozmiar 70 μm). Umyj pożywką DNazy (3-5 ml) wszystkie używane narzędzia i przefiltruj.
Używając tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml, rozgnieć tkankę o sitko, filtrując zimną pożywką DNazy (30 do 35 ml).
Umyj sitko komórkowe zimną pożywką DNazy.
Wirować w temperaturze 4 °C, 314 x g przez 6 min.
Odrzucić supernatant i zawiesić go ponownie w 1 ml kompletnej pożywki.
Policz komórki (oczekiwana ilość powinna wynosić od 8 x 10 5 do 1,2 x 10⁶ komórek o żywotności >80%) za pomocą automatycznego licznika komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Izolacja mysiego dziąsła. Ilustracja przedstawiająca granice rozwarstwienia w szczęce i izolowanym segmencie dziąsła, który ma być wykorzystany do wypreparowania tkanki dziąsła. (B) Segment mysiej szczęki (obszar trzonowy) z zarysem do rozwarstwienia bloku i izolowanym blokiem. Barwienie hematoksyną i eozyną (H&E) odcinka trzonowca szczęki z zarysowanymi tkankami dziąseł pokazano w małym (C), a większe powiększenie w ...