$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Próbki tkanki płucnej
UWAGA: Do badań in vivo tkanki płucnej, badaj próbki po odpowiedniej ekspozycji. Ekspozycja, która jest najbardziej istotna w tym eksperymencie, to zakaźne mikroorganizmy, w szczególności bakterie. Szczepy myszy, które można wykorzystać do tej metody, to myszy C57BL/6 lub BALB/c, w wieku 10 - 12 tygodni, o wadze 25 - 30 g i samce.
- Poddaj myszy eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (400 mg/kg) i ksylazyny (40 mg/kg). Otwórz klatkę piersiową i odsłoń płuca i serce za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek.
- Wlej ciepły PBS za pomocą igły o rozmiarze 21 do prawej komory, aby wypłukać krew z naczyń przez 30 s, a następnie wlej 10 ml utrwalacza 2% PLP przez 30 s (do prawej komory).
- Użyj ciepłego PBS (42 °C) do przepłukania otwartej jamy klatki piersiowej. Zaintubować tchawicę za pomocą igły o rozmiarze 21 G i kawałka rurki o średnicy 0,8 mm przyciętego na wymiar i wstrzyknąć 800 μl wstępnie podgrzanego (do 42 °C) roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
- Zwiąż tchawicę plecionym jedwabiem (4,0 USP). Umieść nić wokół tchawicy, tuż poniżej punktu wprowadzenia kaniuli i zabezpiecz ją za pomocą prostego węzła naręcznego. Aby zestalić agarozę, podawaj lodowaty PBS wokół płuc. Usuń płuca i serce jako blok z jamy klatki piersiowej za pomocą nożyczek i rozwarstwienia. Usunąć każde płuco z osobna, a następnie utrwalić je przez 16 godzin w 2% PLP lub formalinie w temperaturze 4 °C.
- Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu podziału tkanki.
- Aby przygotować próbki tkanki płucnej, wykonaj następujące czynności.
- Utrwalić tkanki płucne (wycięte w kroku 1.1) w 10% naturalnie buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieś do 75% etanolu i umieść w procesorze tkankowym w cyklu 12-godzinnym (2,5 godziny w 75% EtOH, 3 godziny w absolutnym EtOH, 3,5 godziny w rozpuszczalniku 3B i 3 godziny w parafinie).
- Osadzanie w standardowej parafinie w celu utworzenia bloków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), które są przechowywane w temperaturze pokojowej.
nuta: Na tym etapie generalnie wygodnie jest wyciąć odcinki płuc w przypadku standardowych szkiełek.
- Wytnij odcinki płuc FFPE o grubości 4 - 5 μm za pomocą mikrotomu i zamontuj je na naładowanych, powlekanych szkiełkach.
- Aby zamontować szkiełka, nałóż 3 krople podłoża montażowego na szkiełka nakrywkowe o wymiarach 60 mm x 24 mm (rozmiar 1,5), odwróć suwak na szkiełku nakrywkowym i wypchnij nadmiar medium. Hermetycznie zamknij je lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie/Mikroskopia próbek tkanki płucnej
- Aby usunąć wosk, należy ponownie nawodnić i wstępnie potraktować próbkę tkanki płucnej FFPE roztworem do pobierania antygenu.
- Szkiełka FFPE suszyć w piekarniku przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Następnie umieść szkiełka w roztworze ksylenu na 30 minut i przenieś do 70% roztworu etanolu na 5 minut w temperaturze pokojowej. Spłucz w wodzie z kranu.
- Umieścić w żaroodpornej folii i poddać pobieraniu antygenu HIER w szybkowarze przez 10 minut w 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Schłodzić przez 20 min. Umyj się dwa razy w wodzie z kranu przez 5 minut na bujaku, a następnie raz z PBS na bujaku.
- Blok z 10% surowicą kurczaka w 5% BSA/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Plamić tkankę.
- Aby zdefiniować MET w makrofagach, dodaj pierwszorzędowe przeciwciała (MMP-9, H3Cit i F4/80) w 1% BSA/PBS przez 16 godzin w 4 °C w rozcieńczeniu 1/100 (szczegółowe informacje na temat ilości przeciwciał podano w Tabeli materiałów). Umyj dwa razy PBS przez 5 minut na bujaku.
- Osiągnąć detekcję fluorescencyjną przez inkubację z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w 1% BSA/PBS przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała to: (1) kurczak anty-mysz 488 (zielony), (2) kurczak anty-koza 594 (czerwony) i (3) osł anty-mysz 647 (daleki czerwony).
- Umyj skrawki w PBS i zamontuj je za pomocą podłoża montażowego zawierającego DAPI do barwienia chromatyny.
- Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą konfokalnej laserowej głowicy skanującej podłączonej do odwróconego mikroskopu.
- Wzbudzić preparat laserami o długości fali 405, 488, 561 i 647 nm. Rób obrazy w pojedynczej płaszczyźnie o wymiarach 512 x 512 pikseli, klikając przycisk sekwencyjnego poziomowania linii (uśrednianie 2 linii) za pomocą obiektywów pneumatycznych 20X 0,1 NA i 40X 1,0 NA olejowych.
- Uzyskać co najmniej dziesięć pól widzenia na sekcję do analizy i danych dla każdego wyniku (tj. 10 pól widzenia dużej mocy (HFOV) dla kontroli, 10 dla stymulowanej próbki itd., dla każdej myszy).
nuta: Aby uzyskać reprezentatywną próbkę całego pola, można zastosować system matrycowy, w którym pole jest podzielone na różne sekcje, a dla każdej innej próbki ta sama matryca jest używana do wyboru pól widzenia (np. pole można podzielić na 9 sekcji, a od środka i 4 rogi, pobiera się dwa HFOV).