Łatwy dostęp do zarodka umożliwił przeprowadzenie eksperymentów mapujących losy komórek przy użyciu kilku podejść, w tym chimer kurczaka i przepiórki oraz ogniskowego znakowania barwnikiem. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę przygotowania jaja, która została zoptymalizowana pod kątem długiego czasu przeżycia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wycinanie okienka w jajach kurzych do badań nad rozwojem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad rozwojem zostały w znacznym stopniu usprawnione dzięki wykorzystaniu zarodka kurczaka jako modelu eksperymentalnego. Łatwy dostęp do zarodka umożliwił przeprowadzenie eksperymentów mających na celu mapowanie losów komórek z zastosowaniem różnych podejść, w tym tworzenia chimery kurcząt i przepiórnic oraz ogniskowego znakowania barwnikami. Ponadto metoda ta pozwala na wprowadzanie zaburzeń molekularnych różnych rodzajów, w tym umieszczanie kulek pokrytych białkami oraz wprowadzanie plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji in ovo. Eksperymenty te dostarczyły istotnych danych na temat rozwoju ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. W wielu z tych badań konieczne jest otwarcie skorupy jaja i ponowne jej zamknięcie bez zakłócania wzrostu zarodka. Zarodek można badać w kolejnych etapach rozwoju poprzez ponowne otwieranie skorupy. Choć istnieje kilka doskonałych metod otwierania jaj kurzych, w niniejszym artykule prezentujemy jedną z nich, która została zoptymalizowana pod kątem długiego czasu przeżywalności. W tej metodzie jajo spoczywa na boku, a w skorupie wycina się niewielkie okno. Po wykonaniu procedury eksperymentalnej skorupa służy do przykrycia jaja na czas jego rozwoju. Przezroczysta taśma plastikowa nałożona na skorupę chroni zarodek i pomaga utrzymać nawodnienie podczas pozostałej części okresu inkubacji. Metoda ta była stosowana od drugiego dnia inkubacji i pozwoliła na przeżycie zarodków aż do późnych etapów rozwoju embrionalnego.
Protokół
1. Wyjmij jaja z inkubatora
- Przechowywać w temperaturze 37°C przy wilgotności względnej ustawionej powyżej 60%.
- Wyjąć jaja; obrócić jaja o 90°, tak aby szeroka podstawa znajdowała się w pozycji poziomej.
2. Przetarcie jaj w celu sterylizacji
- Nasącz stos niesterylnej gazy 70% etanolem.
- Użyj od dwóch do trzech kawałków gazy, aby zebrać do 5 jaj. Wyrzuć gazę, gdy zostanie zabrudzona.
3. Przygotowanie miejsca usuwania albuminy
- Odetnij i przyklej kawałek plastikowej taśmy 3M o wymiarach 1" x 1" po lewej stronie podstawy, aby zabezpieczyć obszar, z którego będzie pobierana albumina.
4. Usuwanie albuminy
- Używając czubka nożyczek, wykonaj mały otwór na środku taśmy.
- Za pomocą strzykawki 10 cc z igłą o rozmiarze 18G i długości 1 cala, powoli wprowadź igłę przez otwór wykonany nożyczkami.
- Wprowadź igłę pod kątem 45°C w kierunku dna jaja.
- Przechyl igłę w stronę środka i pobierz od 3 do 4 mL białka jaja.
5. Okienkowanie
- Wytnij kawałek plastikowej taśmy o wymiarach 3" x 3" i rozciągnij go tak, aby pasował do górnej części jaja. Rozciągnij narożniki kwadratu wokół zaokrąglonych krawędzi poziomej powierzchni jaj, uważając, aby nie ciągnąć zbyt mocno. Naciągnij taśmę tak, aby ściśle przylegała do powierzchni jaj, bez żadnych zagięć.
- Używając ostrych, prostych nożyczek do sekcji o długości 4", wykonaj otwór w dolnym centrum obszaru, w którym umieszczono taśmę. Powoli wprowadź dolne ostrze nożyczek do wnętrza jaja, dbając o to, aby końcówki przylegały do wewnętrznej strony skorupki. Skieruj ostrze w stronę podstawy i powoli zacznij wycinać skorupkę. Kontynuuj wycinanie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, zatrzymując się tuż przed osiągnięciem górnego centrum. Wyjmij nożyczki i powtórz czynność w przeciwnym kierunku, aż pozostanie jedynie niewielki fragment przytwierdzonego jaja. Sprawdź, czy jajo jest zapłodnione. Zamknij okienko.
6. Zamknięcie, ponowne otwarcie i uszczelnienie jaja.
- Wytnij kawałek plastikowej taśmy o długości około 2-3" i szerokości 1/2", a następnie zamknij okno tak, aby pasowało ono z powrotem do wyciętego otworu. Pobierz kolejny fragment taśmy o wymiarach 1 x 1" i uszczelnij otwór, przez który odprowadzono zawartość jaja. Użyj pęsety, aby ponownie otworzyć jajo w celu wykonania manipulacji. Gdy będziesz gotowy do przeniesienia jaj z powrotem do inkubatora, wytnij kawałek taśmy wystarczająco duży, aby uszczelnić okno i pokryć całą poziomą powierzchnię jaja.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta umożliwia długie przeżycie po manipulacjach eksperymentalnych. Na przykład badania z wykorzystaniem znakowania barwnikami pozwoliły na przeżycie do etapu E10 lub później w badaniu mapowania losów komórek (1). Ponadto metoda ta była stosowana w badaniach elektroporacji in ovo, które zapewniają zmianę poziomów ekspresji genów i wymagają rozwoju do późniejszych etapów rozwojowych (2-6). Tę technikę tworzenia okna można stosować w połączeniu z każdą procedurą wymagającą przeżycia zarodka po przeprowadzonych manipul...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Inkubator obrotowy | Profi | Utrzymywać w temperaturze 37°C przy wilgotności względnej powyżej 60% | ||
| 70% EtOH | ||||
| gaza | ||||
| taśma plastyczna 3M | ||||
| strzykawka 10 cc | 1/jajko | |||
| igły 18G | igła 1½ cala, 1/strzykawkę | |||
| Nożyce do sekcji | ostre proste ostrza 4" | |||
| Zapłodnione jaja |
Bibliografia
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
