Oknowe jaja kurze do badań rozwojowych

Summary

Łatwość dostępu do embrionu pozwoliła na eksperymenty mapowania losów komórek przy użyciu kilku podejść, w tym chimer przepiórczych piskląt i etykietowania barwnikiem ogniskowym. W tym artykule przedstawiamy jedną metodę przygotowania jaj, która została zoptymalizowana pod kątem długiego czasu przeżycia.

Abstract

Badania nad rozwojem zostały znacznie wsparte przez wykorzystanie zarodka pisklęcia jako modelu eksperymentalnego. Łatwość dostępu do zarodka pozwoliła na eksperymenty mające na celu mapowanie losów komórek przy użyciu kilku podejść, w tym chimer przepiórek piskląt i znakowania barwnikiem ogniskowym. Ponadto pozwala na zaburzenia molekularne kilku typów, w tym umieszczanie kulek pokrytych białkiem i wprowadzanie plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji in ovo. Eksperymenty te dostarczyły ważnych danych na temat rozwoju ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. W przypadku wielu z tych badań konieczne jest otwarcie skorupki jaja i ponowne zamknięcie jej bez zakłócania wzrostu zarodka. Zarodek może być badany w kolejnych stadiach rozwojowych poprzez ponowne otwarcie skorupki jaja. Chociaż istnieje kilka doskonałych metod otwierania jaj kurzych, w tym artykule przedstawiamy jedną metodę, która została zoptymalizowana pod kątem długiego czasu przeżycia. W tej metodzie jajko spoczywa na boku, a w skorupce wycina się małe okienko. Po procedurze eksperymentalnej skorupka służy do przykrycia jaja na czas jego rozwoju. Przezroczysta plastikowa taśma pokrywająca skorupkę jajka chroni zarodek i pomaga utrzymać nawodnienie przez pozostałą część okresu inkubacji. Metodę tę stosowano od dwóch dni inkubacji i umożliwiła przeżycie do dojrzałego wieku embrionalnego.

Protocol

1. Usuń jaja z inkubatora

1. Utrzymuj w temperaturze 37°C przy wilgotności względnej ustawionej powyżej 60%.
2. Wyjmij jajka, obróć jajka o 90° tak, aby duża podstawa leżała poziomo.

2. Wymazuj jajka do sterylizacji

1. Nasącz stos niesterylnej gazy 70% etanolem.
2. Użyj dwóch do trzech kawałków, aby wymazać do 5 jaj. Wyrzuć, gdy gaza jest zabrudzona.

3. Przygotowanie miejsca do usuwania białka

1. Wytnij i umieść kawałek plastikowej taśmy 3M o wymiarach 1 x 1 cal po lewej stronie podstawy, aby chronić obszar, z którego zostanie wyciągnięta albumina.

4. Usuwanie białka

1. Użyj czubka nożyczek, aby zrobić mały otwór na środku taśmy.
2. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 cm3 z igłą o rozmiarze 18 cali powoli przewiercić igłę przez otwór wykonany przez nożyczki.
3. Wbić igłę w dół pod kątem 45°C w kierunku dna jajka.
4. Przechylić igłę w kierunku środka i pobrać od 3 do 4 ml białka.

5. Okienkowanie

1. Wytnij kawałek plastikowej taśmy o wymiarach 3 x 3 cale i rozciągnij go, aby zmieścił się na wierzchu jajka. Rozciągnij rogi kwadratu wokół zaokrąglonych końców poziomej powierzchni jaj, uważając, aby nie ciągnąć zbyt mocno. Pociągnij taśmę tak, aby ściśle przylegała do powierzchni jaj bez fałd.
2. Za pomocą ostrych, prostych 4-calowych nożyczek do preparowania przekręć otwór w dolnej środkowej części obszaru, w którym umieszczono taśmę. Powoli wsuń dolne ostrze nożyczek w jajko, upewniając się, że końcówki przylegają do wnętrza skorupki. Skieruj ostrze w stronę podstawy i powoli zacznij ciąć skorupę. Postępuj w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, zatrzymując się tuż przed dotarciem do górnego środka. Wyjmij nożyczki i powtarzaj w przeciwnym kierunku, aż pozostanie tylko niewielka część jajka. Sprawdź, czy jajo jest zapłodnione. Zamknij okno.

6. Zamykanie, ponowne otwieranie i pieczętowanie jajka.

1. Wytnij plastikową taśmę o długości około 2-3 cali i szerokości 1/2 cala i zamknij okno, aby pasowało z powrotem do wyciętego otworu. Weź kolejny kawałek taśmy 1 x 1" i uszczelnij otwór, z którego jajko zostało odsączone. Użyj kleszczy, aby ponownie otworzyć jajko, aby wykonać wszelkie manipulacje. Kiedy będziesz gotowy do zwrócenia jaj do inkubatora, odetnij kawałek taśmy, który jest wystarczająco duży, aby uszczelnić okno i pokryć całą poziomą powierzchnię jaja.

Discussion

Metoda ta pozwala na uzyskanie długiego czasu przeżycia po manipulacjach eksperymentalnych. Na przykład badania znakowania barwnikami pozwoliły na przeżycie do E10 lub później w badaniu mapowania losu (1). Ponadto jest stosowany w badaniach elektroporacji in ovo, które zapewniają zmianę poziomów ekspresji genów i wymagają rozwoju, aby przejść do późniejszych etapów rozwoju (2-6). Ta technika okienkowania może być stosowana w połączeniu z każdą procedurą, która wymaga przeżycia po manipulacjach zarodkiem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inkubator		obrotowy Profi		Maintain na poziomie 37° Stopnie przy wilgotności względnej ustawionej powyżej 60%
70% EtOH
gaza
3M plastikowa taśma
10cc strzykawka				1 / jajko
18G igły				1½ igła calowa, 1/strzykawka
Nożyczki do rozwarstwiania				4-calowe ostre, proste ostrza
Zapłodnione jaja