Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Podsumowanie

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Streszczenie

W przeciwieństwie do innych metod chromatograficznych służących do oczyszczania białek (np. filtracji żelowej, powinowactwa i wymiany jonowej), chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) zazwyczaj wymaga wyznaczenia eksperymentalnego (zwanego przesiewaniem lub „rozpoznaniem”), aby wybrać najodpowiedniejsze medium chromatograficzne do oczyszczenia danego białka ¹. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu opisuje zautomatyzowane podejście do wyszukiwania optymalnego medium HIC do zastosowania w oczyszczaniu białek.

HIC oddziela białka i inne biomolekuły od surowego lizatu na podstawie różnic w hydrofobowości. Podobnie jak chromatografia powinowactwa (AC) i chromatografia wymiany jonowej (IEX), HIC umożliwia zagęszczenie białka docelowego w trakcie procesu chromatograficznego. Do oczyszczania metodą HIC najlepiej nadają się białka posiadające hydrofobowe regiony powierzchniowe oraz zdolne do zniesienia ekspozycji na stężenia soli przekraczające 2 M siarczanu amonu ((NH₄)₂SO₄). HIC jest często wybierana jako metoda oczyszczania białek pozbawionych znaczników powinowactwa, co czyni je nieodpowiednimi do AC, a także w sytuacjach, gdy IEX nie zapewnia wystarczającego stopnia oczyszczenia. Hydrofobowe grupy na powierzchni białka wiążą się tymczasowo z niepolarnym ligandem sprzężonym z obojętną, nieruchomą matrycą. Oddziaływanie między białkiem a ligandem jest silnie zależne od stężenia soli w buforze przepływającym przez kolumnę chromatograficzną, przy czym wysokie stężenia jonowe wzmacniają oddziaływanie białko-ligand i unieruchamiają białko (tzn. wiążą je wewnątrz kolumny) ². Wraz ze spadkiem stężenia soli oddziaływanie białko-ligand zanika, białko ponownie staje się ruchome i eluiuje z kolumny. Kilka rodzajów wypełnień HIC jest dostępnych komercyjnie w kolumnach wstępnie wypełnionych, z których każda zawiera jeden z kilku ligandów hydrofobowych (np. S-butylowy, butylowy, oktylowy i fenylowy) sieciowanych z różną gęstością do kuleczek agarozy o określonej średnicy ³. Zautomatyzowany screening kolumn pozwala na efektywne określenie, które wypełnienie HIC należy zastosować w przyszłych, bardziej szczegółowych eksperymentach optymalizacyjnych i procesach oczyszczania białek ⁴.

Białkiem poddanym w tym przypadku oczyszczaniu jest rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP); podejście to można jednak dostosować do oczyszczania innych białek posiadających jeden lub więcej hydrofobowych regionów powierzchniowych. GFP służy jako przydatne białko modelowe ze względu na swoją stabilność, unikalny pik absorbancji światła przy 397 nm oraz fluorescencję pod wpływem światła UV ⁵. Lizat bakteryjny zawierający GFP typu dzikiego przygotowano w buforze o wysokim zasoleniu, wprowadzono do systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej Bio-Rad DuoFlow i zaadsorbowano na kolumnach HiTrap HIC zawierających różne media HIC. Białko eluowano z kolumn i analizowano za pomocą metod detekcji on-line oraz po zakończeniu procesu. Mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki przez pętlę, sekwencyjny wybór kolumny, analiza wielodługościowa oraz zbieranie frakcji eluatu w rozdzielaczach zwiększyły funkcjonalność systemu i powtarzalność podejścia eksperymentalnego.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i próbki

1. Uwaga techniczna: Wszystkie bufory powinny być przechowywane w lodówce, a każdy etap niniejszego protokołu powinien być przeprowadzany na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Niska temperatura jest niezbędna, aby zapobiec degradacji oczyszczanego białka i zapewnić optymalne warunki pracy. Media HIC mogą dawać różne wyniki rozdziału w temperaturze pokojowej, dlatego system chromatograficzny należy uruchamiać w chłodni o temperaturze 4 °C lub w komorze chłodzącej.
2. Przygotować 500 ml następujących buforów: 200 mM NaH₂PO₄ (Bufor A1), 200 mM Na₂HPO₄ (Bufor A2) oraz 4.8 M (NH₄)₂SO₄ (Bufor B2). Wykorzystywana będzie również woda dejonizowana (Bufor B1). Odgazować bufory, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. Moduł mieszający systemu połączy bufory A1 i A2 w celu przygotowania niskosolnego fosforanowego buforu elucyjnego oraz połączy bufory B1 i B2 w celu przygotowania wysokosolnego siarczanowego buforu startowego (2.4 M (NH₄)₂SO₄).
3. Przygotować 20 ml próbki do nałożenia, mieszając 10 ml lizatu komórkowego zawierającego białko do oczyszczenia z 10 ml Buforu B2. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2.4 M (NH₄)₂SO₄, co czyni go w przybliżeniu równoważnym buforowi startowemu. Lizat komórkowy można przygotować poprzez resuspensję osadu komórek bakteryjnych w buforze TE (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8.0), a następnie przeprowadzenie sonikacji lub dodanie 1 mg/ml lizozymu i odwirowanie przy 3,700 × g przez 10 minut.
4. Przefiltrować mieszaninę lizatu i buforu przez strzykawkowy filtr 0.45 μm o niskim powinowactwie do białek, aby usunąć z roztworu cząstki stałe. Próbkę przechowywać na lodzie do momentu nałożenia na system.

2. Konfiguracja fizyczna i hydraulika systemu chromatograficznego DuoFlow

1. Upewnij się, że wszystkie połączenia zasilania i komunikacji urządzenia zostały wykonane. Urządzenia powinny być widoczne w oknie sterowania ręcznego oprogramowania do chromatografii Biologic DuoFlow. Podsumowanie urządzeń znajduje się w Tabeli 1. Ilustracja systemu oraz schemat połączeń hydraulicznych przedstawione są na Rysunku 2.
2. Podłącz połączenia elektryczne zaworów do stacji roboczej pompy i portów systemowego maximizera w taki sposób, aby numeracja portów następowała w logicznej sekwencji. Oznacz każdy zawór odpowiednim numerem portu do późniejszego wykorzystania. Stacja robocza pompy i systemowy maximizer służą jako główne połączenia komunikacyjne między komputerem/sterownikiem a systemem chromatograficznym. Zawory zostaną automatycznie rozpoznane i wyświetlone w oprogramowaniu po podłączeniu do dowolnego z tych urządzeń.
3. Uwaga techniczna: Podczas pracy systemu chromatograficznego w trybie ręcznym zawory są sterowane niezależnie. Przed rozpoczęciem przepływu buforu należy upewnić się, że skonfigurowano pożądaną ścieżkę przepływu, szczególnie podczas przełączania zaworów.
4. Zanurz rurki teflonowe w buforach A1, A2, B1 i B2. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie objętości buforu na cały protokół i że rurki pozostaną zanurzone. Przygotowanie 500 ml buforów A1, A2 i B2 oraz 1 L buforu B1 będzie wystarczające.
5. Podłącz zawór załadowania próbki i dynamiczną pętlę próbkowania zgodnie z ilustracją na Rysunku 2 oraz zgodnie z instrukcjami producenta. Połącz pętlę próbkowania z wlotem zaworu próbek (pozycja 3), używając możliwie najkrótszego odcinka rurki. Zminimalizuje to rozcieńczenie próbki podczas procesu ładowania próbki.
6. Zminimalizuj długość rurki między próbką, pompą załadowującą próbkę a wlotem zaworu załadowania próbki (pozycja 2). Pozwoli to zmniejszyć ilość próbki niezbędną do załadowania pętli próbkowania.
7. Przygotuj 8 identycznych par rurek PEEK o średnicy zewnętrznej 1/16", gdzie każda para jest połączona złączką żeńska 1/4-28 do żeńska 1/4-28. Podłącz pary do pozycji 1-8 dwóch zaworów wyboru kolumny. 7 złączek podłączonych szeregowo do pozycji 2-8 zaworu wyboru kolumny zostanie później zastąpione kolumnami chromatograficznymi przeznaczonymi do testów. Złączka podłączona szeregowo do pozycji 1 pozostanie jako obejście kolumny chromatograficznej.
8. Uwaga techniczna: Upewnij się, że każda para rurek jest podłączona do tej samej pozycji w obu zaworach wyboru kolumny.
9. Włącz lampę detektora UV/Vis o 4 długościach fal (QuadTec) oraz lampę detektora UV o stałej długości fali 280 nm. Długości fal mierzone przez QuadTec w tym protokole obejmują 214 nm, 280 nm i 397 nm. Pomiar 280 nm zarówno detektorem UV o stałej długości fali, jak i QuadTec zapewnia redundancję systemu i gwarantuje poprawność danych.
10. Potwierdź, że wszystkie detektory zostały skalibrowane zgodnie z instrukcjami producenta. Regulator przeciwciśnienia jest niezbędny do ograniczenia gromadzenia się pęcherzyków powietrza w detektorach i powinien być zainstalowany za detektorami, ale przed monitorem pH.
11. Zaprezentowany tutaj system zawiera dwa kolektory frakcji, co zapewnia znaczną wygodę podczas analizy eluatu po uruchomieniu procesu. Podłącz kolektory frakcji, zawór rozdzielający strumień i sterownik rozdzielacza zgodnie z ilustracją na Rysunku 2. Kolektor frakcji podłączony do pozycji 1 zaworu rozdzielającego będzie zbierać frakcje eluatu o objętości 900 μl do probówek hodowlanych 12 ml, natomiast kolektor frakcji podłączony do pozycji 2 będzie zbierać frakcje eluatu o objętości 100 μl do mikropłytek miareczkowych z 96 dołkami.
12. Kolektor frakcji w pozycji 2, zawór rozdzielający i sterownik rozdzielacza są obsługiwane poza stacją roboczą chromatografu. Sterownik rozdzielacza znajduje się w pompie Bio-Rad Econo Gradient; jednak komponent pompy tego urządzenia nie jest używany. Opcja ustawienia „% Split” zostanie wyświetlona na pompie Econo Gradient po podłączeniu do niej zaworu rozdzielającego.
13. Ustaw % Split na 10. Kolektor frakcji w pozycji 1 zbierze 90% eluatu (900 μl/frakcja), a kolektor frakcji w pozycji 2 zbierze 10% (100 μl/frakcja). Kolektory frakcji będą posuwać się synchronicznie, co pozwoli na wzajemne dopasowanie numerów frakcji obu kolektorów.
14. Zastąp standardową głowicę dozującą kolektora frakcji w pozycji 2 głowicą dozującą do mikropłytek. Głowica do mikropłytek ma mniejszy otwór, co pozwala na zbieranie kropli o 50% mniejszej wielkości (tj. 25 μl zamiast standardowych 50 μl) i jest to szczególnie korzystne przy zbieraniu frakcji ≤ 500 μl.
15. Za pomocą ekranowego panelu sterowania ustaw kolektor frakcji w pozycji 2 tak, aby zbierał frakcje do płytek 96-dołkowych i przesuwał się z prędkością 1 próbka/minutę. Sterownik rozdzielacza i kolektor frakcji w pozycji 2 zostaną uruchomione ręcznie natychmiast po rozpoczęciu pierwszego przebiegu chromatograficznego.
16. Przepłucz kolektor frakcji w pozycji 2 oraz głowicę dozującą do mikropłytek buforem B1.

3. Przygotowanie linii systemu, programowanie metody rozdziału i równoważenie kolumn HIC

1. Zanurzywszy linie wlotowe systemu maximizer w odgazowanych buforach A1, A2, B1 i B2, zaprzeszczaj pompy stacji roboczej, przepłucz pętlę próbkową oraz przemyj system chromatograficzny zgodnie z instrukcjami producenta. Dokończ etap zaprzeszczania dla wszystkich 4 wlotów systemu maximizer (A1, A2, B1 i B2), aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza.
2. Przygotowanie systemu wymaga ręcznego sterowania kontrolerem systemu za pomocą oprogramowania BioLogic. Przed uruchomieniem przepływu buforu potwierdź prawidłowe ustawienie zaworu załadunku próbek oraz zaworów wyboru kolumny.
3. Przygotuj się do uruchomienia ręcznego przepływu buforu elucyjnego (0 %B) przez system z prędkością 1 ml/minutę, zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.5.
4. W oknie konfiguracji (Setup) oprogramowania BioLogic wybierz opcje „Use Buffer Blending” oraz „Phosphate Buffer with Ammonium Sulfate”. Potwierdź, że bufory A1, A2, B1 i B2 wymienione w oknie konfiguracji odpowiadają buforom przygotowanym.
5. Ręcznie ustaw szybkość przepływu buforu elucyjnego (0 %B) na 1 ml/minutę. Obserwuj, czy ciśnienie wsteczne, przewodność, zapisy UV i pH pozostają stałe i mieszczą się w normalnych granicach roboczych. Odchylenia wskazują na obecność powietrza lub zablokowanie kolumny, co należy rozwiązać przed kontynuacją.
6. Przepłucz wszystkie 8 linii wyboru kolumny za pomocą 5 ml buforu elucyjnego. Zrób to, najpierw zatrzymując przepływ, ustawiając oba zawory wyboru kolumny w pozycji 2 i wznawiając przepływ 1 ml/minutę, 0 %B. Powtórz czynność dla linii wyboru kolumny w pozycjach 3-8.
7. Podłącz kolumny HiTrap HIC 1 ml do pozycji 2-8 zaworów wyboru kolumny. Wykonaj kroki 3.8-3.13 dla jednej kolumny naraz. Zanotuj, która kolumna HIC została umieszczona w której pozycji zaworu wyboru. Podsumowanie charakterystyki wypełnień kolumn HIC znajduje się w Tabeli 2.
8. Fizyczne połączenie kolumn GE Healthcare HiTrap z systemem Bio-Rad DuoFlow wymaga zastosowania serii złączek 1/4-28, M6 oraz złączek Luer. Usuń złączkę łączącą zawory wyboru kolumny w pozycji 2. Wyrównaj złączki Bio-Rad i GE Healthcare zgodnie z ilustracją na Rysunku 3.
9. Podłącz przednie złączki kolumny do DuoFlow. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kolumnie lub przewodach, mocno przytwierdź przednie złączki kolumny do przedniej złączki zaworu wyboru. Przepuszczaj bufor elucyjny przez złączki, aż całe powietrze zostanie usunięte i pojawi się duża kropla buforu. Tymczasowo zatrzymaj przepływ buforu.
10. Usuń korek podłączony do wlotu kolumny i nanieś dużą kroplę buforu o niskiej zawartości soli (0 %B) na górę kolumny. Podłącz kolumnę do przednich złączek. Zapewnienie, że zarówno wlot kolumny, jak i złączka wlotowa przelewają się kroplami buforu, gwarantuje połączenie wolne od pęcherzyków powietrza.
11. Jeśli kolumna jest używana po raz pierwszy, odłam końcówkę wylotową kolumny. Podłącz wylot do tylnych złączek kolumny i przewodów zaworu wyboru. Sprawdź, czy wszystkie złączki są mocno dokręcone.
12. Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 psi. Przemyj kolumnę 5 objętościami kolumny (5 objętości kolumny = 5 ml) buforu elucyjnego (0 %B) przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Kontynuuj płukanie kolumny, jeśli jest to konieczne, aż pH, zapisy UV i ciśnienie wsteczne się ustabilizują.
13. Przemyj kolumnę 10 objętościami kolumny (10 ml) buforu startowego (100 %B) przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Kontynuuj płukanie kolumny, jeśli jest to konieczne, aż parametry systemu wymienione w poprzednim kroku oraz przewodność się ustabilizują.
14. Przygotowana w powyższy sposób kolumna HIC jest teraz gotowa do załadunku próbki. Po przygotowaniu wszystkich kolumn do testów, ręcznie przełącz zawory wyboru kolumny w pozycję 1 (złączka) i zatrzymaj przepływ buforu.

4. Nakładanie próbek

1. Zanurz rurkę wlotową próbki w 20 ml próbki, aby rozpocząć proces ładowania próbki do dynamicznej pętli pobierania. W oknie ustawień ręcznych oprogramowania BioLogic przełącz zawór ładowania/płukania pętli na Pozycję 1 (Próbka), a zawór ładowania próbki na tryb Purge (Przepłukiwanie).
2. Uruchom pompę ładowania pętli, aby zassać próbkę do rurki pompy z szybkością przepływu 1 ml/minutę, aż próbka dotrze do zaworu ładowania próbki. Pozwala to na usunięcie buforu i/lub powietrza z linii ładowania próbki.
3. Zatrzymaj przepływ pompy ładowania i przełącz zawór ładowania próbki z trybu Purge na Load (Ładowanie). Ponownie uruchom pompę ładowania pętli z szybkością przepływu 1 ml/minutę, aż do dynamicznej pętli pobierania zostanie zassane 10 ml próbki.
4. Do dynamicznej pętli pobierania załadowano teraz wystarczającą ilość próbki dla maksymalnie 10 sekwencyjnych przebiegów rozpoznawczych na kolumnie HIC.

5. Programowanie metody w oprogramowaniu i uruchamianie protokołu poszukiwania kolumny

1. W oknie Setup oprogramowania BioLogic należy wybrać urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w Tabeli 1.
2. Wybierz 6 kolumn HIC do analizy. Zaprogramuj liniowy malejący gradient soli oraz metodę wstępnego badania (scouting) dla 6 kolumn, zgodnie z ilustracją w Tabeli 3. Program metody jest modyfikacją konfiguracji kolumn HIC w oprogramowaniu BioLogic i został zoptymalizowany dla obecnego zastosowania.
3. Zaleca się metodę wstępnego badania dla 6 kolumn ze względu na ograniczenia kolektora frakcji. Wszystkie 7 kolumn można poddać badaniu wstępnemu, jeśli metoda programu zostanie zmodyfikowana tak, aby zbierać większe objętości frakcji. Nie dodawaj etapu badania wstępnego, dopóki program nie zostanie w pełni ukończony, ponieważ wybranie funkcji scouting uniemożliwia późniejszą edycję.
4. Rozpocznij przebieg badania wstępnego. Ręcznie uruchom przepływ buforu startowego (100 %B) z prędkością 1 ml/minute. Naciśnij start na sterowniku rozdzielacza, aby rozpocząć rozdzielanie strumienia eluatu w stosunku 90%-10% odpowiednio między kolektorem frakcji z probówkami hodowlanymi 12 ml (Pozycja 1) a kolektorem frakcji z płytką 96-dołkową (Pozycja 2). Uwaga techniczna: Należy pamiętać, że kolektor frakcji z płytką 96-dołkową jest obsługiwany offline, poza oprogramowaniem BioLogic.
5. Uruchom metodę programu. Natychmiast po rozpoczęciu przebiegu metody programu naciśnij start na ekranowym panelu sterowania offline kolektora frakcji z płytką 96-dołkową. Jeśli dwa kolektory frakcji nie są w 100% zsynchronizowane, ręcznie przesuń offline kolektor frakcji z płytką 96-dołkową w momencie, gdy drugi kolektor przesuwa się do drugiej probówki zbierającej frakcję.
6. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry przebiegu. Ciśnienie wsteczne, przewodność i %B (Rysunek 4) to parametry przebiegu, które można monitorować, aby zapewnić powtarzalność warunków przebiegu między kolumnami. Należy również monitorować pozycjonowanie zaworów, pH oraz załadunek próbki. Można porównać zapisy UV, aby zweryfikować podobne piki elucji przepływowej.
7. Wykorzystaj techniki analizy eluatu w linii oraz po przebiegu, aby zidentyfikować profil elucji i oczyszczanie białka zainteresowania (tj. „białka docelowego”).
8. W przypadku próbek zawierających GFP, obserwuj elucję w linii, korzystając z unikalnej absorbancji UV białka przy 397 nm. Porównaj zapis absorbancji specyficznej dla GFP przy 397 nm z ogólnym zapisem absorbancji białek przy 280 nm, aby ocenić względne rozdzielenie i oczyszczanie przy użyciu różnych badanych mediów HIC (Rysunek 5).
9. Analiza GFP i innych białek docelowych po przebiegu może być przeprowadzona wieloma metodami. Alikwoty 5-50 μl z frakcji na płytce 96-dołkowej można przenieść na nową płytkę i przebadać pod kątem zawartości specyficznego białka za pomocą metody ELISA lub western blot, a całkowitą zawartość białka w każdej frakcji można przeanalizować, stosując konwencjonalne SDS-PAGE lub mikrofluidyczny system elektroforezy Experion. Fluorescencję GFP można wykryć w probówkach hodowlanych 12 ml przy użyciu światła UV (Rysunek 6).
10. Identyfikację najbardziej obiecujących mediów HIC można przeprowadzić poprzez porównanie elucji GFP w stosunku do innych białek zawartych w próbce. Oczyszczanie z najbardziej obiecującymi mediami HIC można następnie zoptymalizować pod kątem innych parametrów, w tym rodzaju i stężenia buforu startowego oraz pH.
11. Uwaga techniczna: Po zakończeniu eksperymentu należy umieścić wszystkie linie wlotowe w Buforze B1 (odgazowane H₂O) i dokładnie przepłukać pompy, zawory oraz wszystkie rurki wodą. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi czyszczenia i długoterminowego przechowywania systemu chromatograficznego i kolumn HIC.

6. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny gradient soli HIC, przewodność oraz ciśnienie kolumny podczas przebiegów rozpoznawczych przedstawiono na Rysunku 4. Zmiana stężenia soli (linia niebieska), mierzona jako procent buforu pobieranego z linii buforów o wysokim zasoleniu, jest typowa dla metodologii HIC. W miarę spadku stężenia soli, białka związane z kolumną ulegają elucji. Przewodność (linia czerwona), która odpowiada obserwowanemu stężeniu soli, jest mierzona w układzie bezpośrednio za detektorami QuadTec i UV. Przesunięcie między zapisami gradientu soli a przewodności wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu z wlotu buforu, przez system, do monitora przewodności. Przez cały czas przebiegu próbki ciśnienie w systemie (linie szare) oraz pH pozostają stosunkowo stałe.

Rycina 5 przedstawia chromatogramy z sekwencyjnych uruchomień testowych kolumny HIC. Detekcja on-line całkowitego białka (A₂₈₀, niebieska linia) oraz GFP (A₃₉₇, zielona linia) jest realizowana poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nm i 397 nm. Porównując obie linie, można przybliżyć względną zawartość GFP oraz stopień rozdzielenia dla każdego z uruchomień testowych. GFP wiązało się z testowanymi kolumnami HIC z różnym stopniem powinowactwa, a jego profil elucji był zróżnicowany. Wybór preferowanej kolumny HIC do przyszłych oczyszczeń opiera się na zidentyfikowaniu kolumny, która generuje najwęższy pik elucji GFP i zapewnia największe oddzielenie od innych białek.

Na Rysunku 6 probówki z kulturami dla frakcji 10, 12, 14, 16 i 18 z próbnego rozdzielania (scouting run) Phenyl FF (wysoka substytucja) zostały zobrazowane w świetle pokojowym (fluorescencyjnym) oraz w świetle ultrafioletowym (UV). Probówki oglądano zarówno od przodu (panele lewe), jak i od góry (panele prawe), aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisji GFP. GFP (kolor zielony) jest wyraźnie wykrywane w frakcji 14 na obu obrazach UV. Te dane pozyskane po zakończeniu rozdzielania dobrze korelują z detekcją GFP w trybie in-line poprzez pomiar absorbancji eluatu przy 397 nm (A₃₉₇, linia zielona), co również wskazuje, że frakcja 14 zawiera główny pik eluowanego GFP. Rozproszone niebieskie światło na lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV.

Rysunek 1. Schematyczny przebieg protokołu. Lizat bakteryjny zawierający białko docelowe (GFP, białko docelowe) zostaje przygotowany, rozcieńczony w buforze o wysokim stężeniu soli, odpowiadającym buforowi startowemu do chromatografii, a następnie przefiltrowany. Po przygotowaniu systemu do chromatografii cieczowej próbka jest nakładana, a białko docelowe zostaje oddzielone od pozostałych białek zawartych w lizacie przy użyciu hydrofobowego medium chromatograficznego znajdującego się w gotowej kolumnie HIC. Metoda rozdziału jest powtarzana kilkakrotnie z użyciem różnych mediów chromatograficznych (tzw. scouting kolumn), aby ustalić, które medium zapewnia najlepszy rozdział GFP. Eluowane białka (eluat) są analizowane w układzie za pomocą detektorów wbudowanych w system chromatograficzny i zbierane w mniejsze frakcje do późniejszej analizy (po zakończeniu procesu). Na podstawie analizy w układzie oraz analizy po zakończeniu procesu w zakresie aktywności i rozdziału GFP wyznacza się optymalną kolumnę HIC oraz medium chromatograficzne.

Tabela 1. Kluczowe komponenty systemu chromatograficznego wykorzystane w tym protokole.

Rysunek 2. Schemat zastosowanego systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej Bio-Rad DuoFlow. Kluczowe funkcje systemu obejmują automatyczne mieszanie buforów, ładowanie próbek do sekwencyjnych przebiegów kolumnowych, automatyczny wybór różnych kolumn chromatograficznych, analizę eluatu w linii oraz tandemowe zbieranie frakcjonowanego eluatu. Szczegóły znajdują się w tekście i w Tabeli 1.

Tabela 2. Charakterystyka biofizyczna testowanych mediów HIC. Nazwa kolumny HiTrap HIC wskazuje na rodzaj ligandu, gęstość ligandów oraz rozmiar kulek.

*FF = szybki przepływ (fast flow); HP = wysoka wydajność (high performance). Większy rozmiar kulek zwiększa pojemność wiązania ligandu i szybkość przepływu. Mniejszy rozmiar kulek zwiększa rozdzielczość chromatograficzną. Informacje pochodzą z literatury dostarczonej przez producenta.

Rycina 3. Połączenie kolumny GE Healthcare HiTrap HIC z systemem Bio-Rad DuoFlow. Do górnej nakrętki i tulejki Delrin 1/4-28 (A1) podłączono złączkę Luer (męska) do 1/4-28 (żeńska) (B1) oraz złączkę 1/16" (męska) do Luer (żeńska) (C). Złączki mocuje się do kolumny HiTrap po przepłukaniu jej buforem i usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza. Wylot kolumny jest połączony z złączką 1/16" (żeńska) do M6 (męska) (D), złączką Luer (męska) do M6 (żeńska) (E) oraz złączką Luer (żeńska) do 1/4-28 (żeńska) (B₂). Cały ten zespół jest połączony z dolną nakrętką i tulejką Delrin 1/4-28 (A₂). Górny panel przedstawia rozdzielone złączki, a dolny panel przedstawia złączki po zmontowaniu.

Krok nr	Objętość (mL)	Opis	Parametry
1	0.00	Zbierać frakcje o objętości 1,0 ml przez cały czas trwania procesu
2	0.00	Zamiana kolumn	Kolumna HIC 1 (Pozycja 2)
3	0.00	Przepływ izokratyczny	pH: 6,80 100% B	Objętość: 2,00 ml Przepływ: 1,00 mL/min
4	2.00	Linia bazowa zero	QuadTec
5	2.00	Poziom odniesienia zero	Detektor UV
6	2.00	Wstrzyknij próbkę	Załadunek próbek Dynamiczna pętla	Zawór automatycznego wtrysku Objętość: 0,50 mL Przepływ: 1,00 ml/min
7	3.00	Przepływ izokracyjny	pH: 6,80 100%B	Objętość: 5,00 mL Przepływ: 1,00 ml/min
8	8.00	Gradient liniowy	pH: 6,80 100%B -> 0%B	Objętość: 10,00 mL Przepływ: 1,00 mL/min
9	18.00	Przepływ izokratyczny	pH: 6,80 0%B	Objętość: 3,00 ml Przepływ: 1,00 ml/min
10	21.00	Przepływ izokratyczny	pH: 6,80 100%B	Objętość: 5,00 mL Przepływ: 1,00 ml/min
11	26.00	Zamiana kolumn	Połączenie (Pozycja 1)
Koniec	26.00	Koniec protokołu	Automatyczne powtórzenia z wykorzystaniem 5 dodatkowych kolumn HIC (Pozycje 3-7)
Typ zwiadowczy		Liczba powtórzeń: 6	Liczba zrekonesansowanych kroków: 1

Tabela 3. Protokół oprogramowania BioLogic dla zastosowanej metody przesiewowej HIC.

Rysunek 4. Reprezentatywny gradient soli HIC, przewodność i ciśnienie w kolumnie. Wraz ze spadkiem stężenia soli (linia niebieska) spada również przewodność (linia czerwona). Przesunięcie między zapisami gradientu soli a przewodnością wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu z wlotu buforu do monitora przewodności. Ciśnienie w układzie (linie szare) pozostaje stosunkowo stałe przez cały czas trwania badania wstępnego.

Rysunek 5. Zestawienie chromatogramów z sekwencyjnych prób wstępnych na kolumnach HiTrap HIC. Detekcja on-line całkowitego białka (A₂₈₀, niebieska linia) i GFP (A₃₉₇, zielona linia) odbywa się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nm i 397 nm. W tej serii doświadczeń najostrzejszy pik elucji GFP zaobserwowano przy użyciu kolumny Phenyl FF (high sub). Kolumna Phenyl FF (high sub) wydawała się również zapewniać największy rozdział między GFP a innymi białkami. Dodatkowo przetestowano kolumny HiTrap HIC o pojemności 1 ml: Phenyl fast flow low substitution (Phenyl FF (low sub)), butyl fast flow (butyl FF), butyl-S fast flow (butyl-S FF) oraz octyl fast flow (octyl FF).

Rycina 6. Reprezentatywna wizualizacja GFP w eluate próbki po przeprowadzeniu rozdziału. Frakcje eluate były zbierane w tempie 1/minutę, a każda z nich została przeanalizowana pod kątem zawartości GFP. Na tej reprezentatywnej rycinie probówki z frakcjami 10, 12, 14, 16 i 18 z próbnego rozdziału Phenyl FF (wysokie podstawienie) zostały zobrazowane w świetle pokojowym (fluorescencyjnym) oraz w świetle ultrafioletowym (UV). Probówki oglądano zarówno od przodu (panele lewe), jak i od góry (panele prawe). Rozproszony niebieski kolor na lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV. GFP (kolor zielony) jest wyraźnie widoczny w frakcji 14 na obu obrazach UV. Górny panel przedstawia przebiegi chromatogramów dla całkowitego białka (A280, linia niebieska) i GFP (A₃₉₇, linia zielona) dla wizualizowanych 5 frakcji.

Dyskusja

Techniki chromatografii cieczowej okazały się nieocenione w przygotowywaniu wysoko oczyszczonych białek niezbędnych do prowadzenia badań immunologicznych ⁶, biochemicznych ⁷ oraz strukturalnych ⁸. Metody oczyszczania za pomocą HIC najczęściej wymagają empirycznego wyznaczenia optymalnego medium, a wykazano, że na wyniki chromatograficzne wpływają struktura ligandu, gęstość ligandu oraz właściwości kulek matrycy ^{2, 3}. Zautomatyzowany dobór kolumny (column scouting) jest efektywnym podejściem do wyboru medium HIC do późniejszej optymalizacji i oczyszczania białek ⁴. Przedstawiona metoda zautomatyzowanego doboru kolumn może być łatwo dostosowana do różnych strategii oczyszczania białek metodą HIC. Warunki oczyszczania mogą zostać dodatkowo ulepszone poprzez zmiany stężenia soli, wybór rodzaju soli, gradientu soli oraz pH, a wpływ tych kluczowych parametrów został omówiony w poprzednich przeglądach ^13,14. Eluat HIC zawierający częściowo oczyszczone białko docelowe może zostać poddany dalszemu oczyszczaniu przy użyciu komplementarnej techniki chromatograficznej, takiej jak chromatografia wymiany jonowej (IEX) lub filtracja żelowa/chromatografia wykluczaniaC ^9,10.

Ze względu na unikalne charakterystyki absorpcji i emisji światła, profil elucji GFP można zidentyfikować, stosując podejścia in-line oraz post-run. W tym celu niniejszy protokół można dalej dostosować do oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych z GFP, w których niepowiązane białko docelowe jest „oznaczone” GFP. Białka docelowe oznakowane GFP mogą być wykrywane za pomocą światła UV ¹¹ i oczyszczane przy użyciu różnych metod chromatograficznych, w tym opisanej powyżej strategii oczyszczania HIC. Oczyszczanie GFP stało się również stałym elementem dydaktycznym w laboratoriach biochemicznych, służącym do nauczania nowoczesnych technik nauki o białkach ¹².

Choć podstawowa puryfikacja białek metodą HIC może być przeprowadzona przy użyciu znacznie mniej zaawansowanego systemu chromatograficznego, instrumentarium przedstawione w niniejszym opracowaniu oferuje szereg wyraźnych zalet ułatwiających uzyskanie korzystnych wyników. Do istotnych korzyści płynących z wykorzystania systemu wysoko zautomatyzowanego należą: lepsza powtarzalność warunków między poszczególnymi przebiegami, oszczędność czasu oraz mniejsze ryzyko wprowadzenia powietrza do układu ¹⁰. Sterowane systemowo mieszanie buforów, realizowane przez moduł maximizer, pozwala na zwiększenie spójności przygotowania buforów oraz powtarzalności eksperymentalnej. Pobranie wystarczającej ilości próbki do dynamicznej pętli próbkowej na wszystkie przebiegi wstępne (scouting runs) zapewnia dodatkowo jednorodność próbki wprowadzanej na każdą kolumnę i umożliwia sekwencyjne uruchamianie analiz bez przerw lub konieczności ręcznego ponownego ładowania. Kontrolowany wtrysk próbki z pętli na kolumnę zmniejsza zmienność, która może wystąpić podczas ręcznego nakładania próbki. Para zaworów wyboru kolumny pozwala na następujące po sobie przebiegi z użyciem różnych kolumn HIC bez konieczności ponownego łączenia przewodów w systemie. Analiza wielodługościowa jest szczególnie korzystna podczas badania białek o unikalnym profilu spektrofotometrycznym. Poza GFP, techniką tą mogą odnieść korzyść cytochromy, flawoproteiny oraz inne białka zawierające hem. Urządzenia do monitorowania przewodnictwa i pH pozwalają na weryfikację warunków eksperymentalnych w czasie rzeczywistym. Rozdzielczy system zbierania frakcji eluatem pozwala na lepszą obsługę frakcji i umożliwia łatki transfer do metod analizy po-runowej wymagających minimalnej objętości próbki (np. ELISA, SDS-PAGE, western blot oraz mikroprzepływowa elektroforeza Experion). Chociaż obsługa drugiego kolektora frakcji w trybie offline wymaga ręcznej synchronizacji, zapewnia ona maksymalną elastyczność w wyborze kolektora. Najistotniejszymi wadami wykorzystania tak zaawansowanego systemu chromatograficznego do doboru kolumny HIC i puryfikacji białek są początkowe nakłady czasu i funduszy związane z zakupem instrumentu oraz szkoleniem operatora.

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje system chromatograficzny Bio-Rad DuoFlow; jednak można również zastosować równie wydajną aparaturę od innych producentów, taką jak ÄKTA Avant firmy GE Healthcare, która pozwala na uzyskanie równoważnych wyników. Nawet porównywalne systemy chromatograficzne posiadają unikalne cechy (np. programowanie metod, nomenklaturę komponentów, preferencje operatora oraz ograniczenia w zakresie skalowalności), które należy wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem procedury oczyszczania lub zakupem urządzenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System BioLogic DuoFlow Pathfinder 20	Bio-Rad	7602257	Obejmuje: system maximizer, mieszalnik, stację roboczą F10, zawór AVR7-3, detektor UV/Vis QuadTec z celą przepływową, kolektor frakcji BioFrac, oprogramowanie BioLogic oraz zestaw startowy
Zawór wyboru strumienia AVR9-8	Bio-Rad	7600408
Zawór przekierowujący SV3-2	Bio-Rad	7500410
Zawór rozdzielający strumień	Bio-Rad	7410017
Zestaw DynaLoop 25	Bio-Rad	7500451
Kolektor frakcji BioFrac	Bio-Rad	7410002	Użyto dwóch kolektorów frakcji
Adapter głowicy kroplującej do mikropłytek BioFrac	Bio-Rad	74010088
Adapter do płytek mikrotitracyjnych BioFrac	Bio-Rad	7410017
Moduł optyki UV	Bio-Rad	7500202
Lampa halogenowa	Bio-Rad	7601331
Pompa gradientowa Econo	Bio-Rad	7319001
System Experion	Bio-Rad	7007001
Zestaw analityczny Experion Pro260	Bio-Rad	7007102
Zestaw do wyboru kolumn HiTrap HIC	GE Healthcare	28-4110-07	Obejmuje 7 x 1 ml wstępnie napełnionych kolumn z wypełnieniem HIC do celów screeningowych
Złączki kolumn GE Healthcare do Bio-Rad	GE Healthcare	18111251 i 18111257