Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Podsumowanie

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Streszczenie

W przeciwieństwie do innych metod chromatograficznych służących do oczyszczania białek (np. filtracji żelowej, powinowactwa i wymiany jonowej), chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) zazwyczaj wymaga wyznaczenia eksperymentalnego (zwanego przesiewaniem lub „rozpoznaniem”), aby wybrać najodpowiedniejsze medium chromatograficzne do oczyszczenia danego białka ¹. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu opisuje zautomatyzowane podejście do wyszukiwania optymalnego medium HIC do zastosowania w oczyszczaniu białek.

HIC oddziela białka i inne biomolekuły od surowego lizatu na podstawie różnic w hydrofobowości. Podobnie jak chromatografia powinowactwa (AC) i chromatografia wymiany jonowej (IEX), HIC umożliwia zagęszczenie białka docelowego w trakcie procesu chromatograficznego. Do oczyszczania metodą HIC najlepiej nadają się białka posiadające hydrofobowe regiony powierzchniowe oraz zdolne do zniesienia ekspozycji na stężenia soli przekraczające 2 M siarczanu amonu ((NH₄)₂SO₄). HIC jest często wybierana jako metoda oczyszczania białek pozbawionych znaczników powinowactwa, co czyni je nieodpowiednimi do AC, a także w sytuacjach, gdy IEX nie zapewnia wystarczającego stopnia oczyszczenia. Hydrofobowe grupy na powierzchni białka wiążą się tymczasowo z niepolarnym ligandem sprzężonym z obojętną, nieruchomą matrycą. Oddziaływanie między białkiem a ligandem jest silnie zależne od stężenia soli w buforze przepływającym przez kolumnę chromatograficzną, przy czym wysokie stężenia jonowe wzmacniają oddziaływanie białko-ligand i unieruchamiają białko (tzn. wiążą je wewnątrz kolumny) ². Wraz ze spadkiem stężenia soli oddziaływanie białko-ligand zanika, białko ponownie staje się ruchome i eluiuje z kolumny. Kilka rodzajów wypełnień HIC jest dostępnych komercyjnie w kolumnach wstępnie wypełnionych, z których każda zawiera jeden z kilku ligandów hydrofobowych (np. S-butylowy, butylowy, oktylowy i fenylowy) sieciowanych z różną gęstością do kuleczek agarozy o określonej średnicy ³. Zautomatyzowany screening kolumn pozwala na efektywne określenie, które wypełnienie HIC należy zastosować w przyszłych, bardziej szczegółowych eksperymentach optymalizacyjnych i procesach oczyszczania białek ⁴.

Białkiem poddanym w tym przypadku oczyszczaniu jest rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP); podejście to można jednak dostosować do oczyszczania innych białek posiadających jeden lub więcej hydrofobowych regionów powierzchniowych. GFP służy jako przydatne białko modelowe ze względu na swoją stabilność, unikalny pik absorbancji światła przy 397 nm oraz fluorescencję pod wpływem światła UV ⁵. Lizat bakteryjny zawierający GFP typu dzikiego przygotowano w buforze o wysokim zasoleniu, wprowadzono do systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej Bio-Rad DuoFlow i zaadsorbowano na kolumnach HiTrap HIC zawierających różne media HIC. Białko eluowano z kolumn i analizowano za pomocą metod detekcji on-line oraz po zakończeniu procesu. Mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki przez pętlę, sekwencyjny wybór kolumny, analiza wielodługościowa oraz zbieranie frakcji eluatu w rozdzielaczach zwiększyły funkcjonalność systemu i powtarzalność podejścia eksperymentalnego.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i próbek

1. Uwaga techniczna: Wszystkie bufory powinny być przechowywane w lodówce, a każdy krok niniejszego protokołu należy przeprowadzać w lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej. Niska temperatura jest niezbędna, aby zapobiec degradacji oczyszczanego białka i zapewnić optymalne warunki pracy. Nośniki HIC mogą dawać różne wyniki rozdziału w temperaturze pokojowej, dlatego system chromatograficzny powinien pracować w chłodni w temperaturze 4 °C lub w komorze chłodzącej.
2. Przygotować po 500 ml następujących buforów: 200 mM NaH₂PO₄ (bufor A1), 200 mM Na₂HPO₄ (bufor A2) oraz 4,8 M (NH₄)₂SO₄ (bufor B2). Wykorzystywana będzie również woda dejonizowana (bufor B1). Odgazować bufory, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. Mieszalnik systemu połączy bufory A1 i A2 w celu wytworzenia fosforanowego buforu elucyjnego o niskim zasoleniu oraz połączy bufory B1 i B2 w celu wytworzenia startowego buforu siarczanowo-amonowego o wysokim zasoleniu (2,4 M (NH₄)₂SO₄).
3. Przygotować 20 ml próbki do nałożenia poprzez zmieszanie 10 ml lizatu komórkowego zawierającego białko do oczyszczenia z 10 ml buforu B2. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2,4 M (NH₄)₂SO₄, co czyni go w przybliżeniu równoważnym buforowi startowemu. Lizat komórkowy można przygotować poprzez resuspensję osadu komórek bakteryjnych w buforze TE (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8.0), a następnie sonikację lub dodanie 1 mg/ml lizozymu i wirowanie przy 3 700 ×g przez 10 minut.
4. Przefiltrować mieszaninę lizatu z buforem przez strzykawkowy filtr 0,45 μm o niskim wiązaniu białek, aby usunąć z roztworu cząstki stałe. Próbkę przechowywać w lodzie do momentu nałożenia na system.

2. Konfiguracja fizyczna i instalacja hydrauliczna systemu chromatografii DuoFlow

1. Upewnij się, że wszystkie połączenia zasilania i komunikacji urządzenia zostały wykonane. Urządzenia powinny być widoczne w oknie sterowania ręcznego oprogramowania do chromatografii Biologic DuoFlow. Podsumowanie urządzeń znajduje się w Tabeli 1. Ilustracja systemu oraz schemat hydrauliczny przedstawione są na Rysunku 2.
2. Podłącz złącza elektryczne zaworów do stacji roboczej pompy oraz portów system maximizer w taki sposób, aby numeracja portów następowała w logicznej kolejności. Oznacz każdy zawór odpowiednim numerem portu dla przyszłych referencji. Stacja robocza pompy i system maximizer służą jako główne połączenia komunikacyjne między komputerem/sterownikiem a systemem chromatograficznym. Zawory zostaną automatycznie rozpoznane i wyświetlone w oprogramowaniu po podłączeniu do któregokolwiek z urządzeń.
3. Uwaga techniczna: Podczas pracy systemu chromatograficznego w trybie ręcznym zawory są sterowane niezależnie. Przed uruchomieniem przepływu buforu należy upewnić się, że skonfigurowano pożądaną ścieżkę przepływu, szczególnie podczas przełączania zaworów.
4. Zanurz rurki teflonowe w buforach A1, A2, B1 i B2. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie objętości buforów dla całego protokołu i że rurki pozostaną zanurzone. Przygotowanie 500 ml buforów A1, A2 i B2 oraz 1 L buforu B1 będzie wystarczające.
5. Podłącz zawór załadunkowy próbki i dynamiczną pętlę próbkowania zgodnie z Rysunkiem 2 i instrukcjami producenta. Połącz pętlę próbkowania z wlotem zaworu próbkowania (Pozycja 3), używając najkrótszego możliwego odcinka rurki. Zminimalizuje to rozcieńczenie próbki podczas procesu załadunku.
6. Zminimalizuj długość rurki pomiędzy próbką, pompą załadunkową a wlotem zaworu załadunkowego (Pozycja 2). Zmniejszy to ilość próbki niezbędną do wypełnienia pętli próbkowania.
7. Przygotuj 8 identycznych par rurek PEEK o średnicy zewnętrznej 1/16", gdzie każda para jest połączona za pomocą złączki żeźka-żeźka 1/4-28. Podłącz pary do pozycji 1-8 dwóch zaworów wyboru kolumny. 7 złączek podłączonych szeregowo do pozycji 2-8 zaworu wyboru kolumny zostanie później zastąpionych kolumnami chromatograficznymi poddanymi badaniu. Złączka podłączona szeregowo z pozycją 1 pozostanie jako obejście kolumny chromatograficznej.
8. Uwaga techniczna: Upewnij się, że każda para rurek jest podłączona do tej samej pozycji w obu zaworach wyboru kolumny.
9. Włącz lampę detektora UV/Vis 4-falowego (QuadTec) oraz lampę detektora UV o stałej długości fali 280 nm. Długości fal mierzone przez QuadTec w tym protokole obejmują 214 nm, 280 nm i 397 nm. Pomiar przy 280 nm za pomocą zarówno detektora UV o stałej długości fali, jak i QuadTec zapewnia redundancję systemu i potwierdza poprawność danych.
10. Potwierdź, że wszystkie detektory zostały skalibrowane zgodnie z instrukcjami producenta. Regulator ciśnienia wstecznego jest niezbędny do zmniejszenia gromadzenia się pęcherzyków powietrza w detektorach i powinien zostać zainstalowany za detektorami, ale przed monitorem pH.
11. System przedstawiony tutaj obejmuje dwa zbieracze frakcji, co znacznie ułatwia analizę eluatu po zakończeniu procesu. Podłącz zbieracze frakcji, zawór rozdzielający strumień oraz sterownik rozdzielacza zgodnie z Rysunkiem 2. Zbieracz frakcji podłączony do pozycji 1 zaworu rozdzielającego będzie zbierał frakcje eluatu o objętości 900 μl do probówek hodowlanych 12 ml, natomiast zbieracz podłączony do pozycji 2 będzie zbierał frakcje o objętości 100 μl do mikropłytek 96-dołkowych.
12. Zbieracz frakcji w pozycji 2, zawór rozdzielający i sterownik rozdzielacza są obsługiwane poza stacją roboczą chromatografii. Sterownik rozdzielacza znajduje się w pompie Bio-Rad Econo Gradient; jednak komponent pompy w tym urządzeniu nie jest używany. Opcja ustawienia „% Split” zostanie wyświetlona na pompie Econo Gradient po podłączeniu do niej zaworu rozdzielającego.
13. Ustaw % Split na 10. Zbieracz frakcji w pozycji 1 będzie zbierał 90% eluatu (900 μl/frakcja), a zbieracz frakcji w pozycji 2 będzie zbierał 10% (100 μl/frakcja). Zbieracze frakcji będą posuwać się synchronicznie, co pozwoli na wzajemną zgodność numeracji frakcji obu urządzeń.
14. Zastąp standardową głowicę dozującą zbieracza frakcji w pozycji 2 głowicą do mikropłytek. Głowica do mikropłytek ma mniejszy otwór, co umożliwia zbieranie kropli o 50% mniejszej wielkości (tj. 25 μl zamiast standardowych 50 μl) i jest szczególnie korzystne przy zbieraniu frakcji ≤ 500 μl.
15. Za pomocą ekranowego panelu sterowania ustaw zbieracz frakcji w pozycji 2 na zbieranie frakcji do płytek 96-dołkowych z prędkością 1 próbka/minuta. Sterownik rozdzielacza i zbieracz frakcji w pozycji 2 zostaną uruchomione ręcznie bezpośrednio po rozpoczęciu pierwszego przebiegu chromatograficznego.
16. Przepłucz zbieracz frakcji w pozycji 2 oraz głowicę do mikropłytek buforem B1.

3. Przesyłanie płynu przez linie systemu, programowanie metody biegu i równoważenie kolumn HIC

1. Zanurzając linie wlotowe systemu maximizer w odgazowanych buforach A1, A2, B1 i B2, zapowietrz pompy stacji roboczej, przepłucz pętlę próbek i przemyj system chromatograficzny zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj etap zapowietrzania dla wszystkich 4 wlotów systemu maximizer (A1, A2, B1 i B2), aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza.
2. Przygotowanie systemu wymaga ręcznego sterowania kontrolerem systemu za pomocą oprogramowania BioLogic. Przed uruchomieniem przepływu buforu potwierdź prawidłowe ustawienie zaworu załadunku próbek oraz zaworów wyboru kolumny.
3. Przygotuj się do ręcznego uruchomienia przepływu buforu elucyjnego (0 %B) przez system z prędkością 1 ml/minute, zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.5.
4. W oknie Setup oprogramowania programu BioLogic wybierz „Use Buffer Blending” oraz „Phosphate Buffer with Ammonium Sulfate”. Potwierdź, że bufory A1, A2, B1 i B2 wymienione w oknie Setup odpowiadają buforom przygotowanym.
5. Ręcznie ustaw prędkość przepływu buforu elucyjnego (0 %B) na 1 ml/minute. Obserwuj, czy ciśnienie wsteczne, przewodność, zapisy UV oraz pH pozostają stałe i mieszczą się w normalnych granicach operacyjnych. Nieprawidłowości wskazują na obecność powietrza lub zablokowanie kolumny, co należy usunąć przed kontynuacją.
6. Przepłucz wszystkie 8 linii wyboru kolumny 5 ml buforu elucyjnego. Zrób to, najpierw zatrzymując przepływ, ustawiając oba zawory wyboru kolumny w pozycji 2 i wznawiając przepływ 1 ml/minute, 0 %B. Powtórz czynność dla linii wyboru kolumny w pozycjach 3-8.
7. Podłącz kolumny HiTrap HIC 1 ml do pozycji 2-8 zaworów wyboru kolumny. Wykonaj kroki 3.8-3.13 dla każdej kolumny po kolei. Zanotuj, która kolumna HIC została umieszczona w której pozycji zaworu wyboru. Podsumowanie charakterystyki wypełnień kolumn HIC znajduje się w Tabeli 2.
8. Fizyczne połączenie kolumn GE Healthcare HiTrap z systemem Bio-Rad DuoFlow wymaga zastosowania serii złączek wykorzystujących gwinty 1/4-28, M6 oraz złączki Luer. Zdejmij złączkę łączącą zawory wyboru kolumny w pozycji 2. Dopasuj złączki Bio-Rad i GE Healthcare zgodnie z ilustracją na Rysunku 3.
9. Przymocuj górne złączki kolumny do DuoFlow. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kolumnie lub w przewodach, mocno przymocuj górne złączki kolumny do górnej złączki zaworu wyboru. Przepuść bufor elucyjny przez złączki, aż całe powietrze zostanie usunięte i pojawi się duża kropla buforu. Tymczasowo zatrzymaj przepływ buforu.
10. Zdejmij korek podłączony do wlotu kolumny i nanieś dużą kroplę buforu o niskim zasoleniu (0 %B) na górę kolumny. Podłącz kolumnę do górnych złączek. Zapewnienie, że zarówno wlot kolumny, jak i złączka wlotowa przelewają się kroplami buforu, gwarantuje połączenie wolne od pęcherzyków powietrza.
11. Jeśli kolumna jest używana po raz pierwszy, odłam końcówkę wylotową kolumny. Podłącz wylot do dolnych złączek kolumny i przewodów zaworu wyboru. Sprawdź, czy wszystkie złączki są szczelnie dokręcone.
12. Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 psi. Przemyj kolumnę 5 objętościami kolumny (5 objętości kolumny = 5 ml) buforu elucyjnego (0 %B) przy prędkości przepływu 1 ml/minute. Kontynuuj przemywanie kolumny, jeśli to konieczne, aż pH, zapisy UV i ciśnienie wsteczne ustabilizują się.
13. Przemyj kolumnę 10 objętościami kolumny (10 ml) buforu startowego (100 %B) przy prędkości przepływu 1 ml/minute. Kontynuuj przemywanie kolumny, jeśli to konieczne, aż parametry systemu wymienione w poprzednim kroku oraz przewodność ustabilizują się.
14. Przygotowana powyżej kolumna HIC jest teraz gotowa do załadunku próbki. Po przygotowaniu wszystkich kolumn przeznaczonych do testów, ręcznie przełącz zawory wyboru kolumny na pozycję 1 (złączka) i zatrzymaj przepływ buforu.

4. Nakładanie próbek

1. Zanurz rurkę wlotową próbki w 20 ml próbki, aby rozpocząć proces ładowania próbki do dynamicznej pętli próbkowania. W oknie ustawień ręcznych oprogramowania BioLogic przełącz zawór ładowania/płukania pętli próbkowania na pozycję 1 (Sample), a zawór ładowania próbki na Purge.
2. Uruchom pompę ładowania pętli próbkowania, zasysając próbkę do rurki pompy z szybkością przepływu 1 ml/minute, aż do momentu dotarcia próbki do zaworu ładowania próbki. Pozwala to na usunięcie buforu i/lub powietrza z linii ładowania próbki.
3. Zatrzymaj przepływ pompy ładowania i przełącz zawór ładowania próbki z pozycji Purge na Load. Ponownie uruchom pompę ładowania pętli próbkowania z szybkością przepływu 1 ml/minute, aż do momentu zassania 10 ml próbki do dynamicznej pętli próbkowania.
4. Do dynamicznej pętli próbkowania załadowano teraz wystarczającą ilość próbki dla maksymalnie 10 sekwencyjnych serii badań przesiewowych kolumny HIC.

5. Programowanie metody oprogramowania i uruchamianie protokołu rozpoznawczego kolumny

1. W oknie Setup w oprogramowaniu BioLogic wybierz urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w Tabeli 1.
2. Wybierz 6 kolumn HIC do analizy. Zaprogramuj liniowy malejący gradient soli oraz metodę wstępnego przesiewu (scouting) dla 6 kolumn, zgodnie z ilustracją w Tabeli 3. Program metody jest modyfikacją konfiguracji kolumn HIC w oprogramowaniu BioLogic i został zoptymalizowany dla obecnego zastosowania.
3. Zaleca się zastosowanie metody przesiewowej dla 6 kolumn ze względu na ograniczenia kolektora frakcji. Możliwy jest przesiew wszystkich 7 kolumn, jeśli program metody zostanie dostosowany do zbierania większych objętości frakcji. Nie dodawaj kroku przesiewowego, dopóki program nie zostanie w pełni ukończony, ponieważ wybranie funkcji przesiewowej uniemożliwia późniejszą edycję.
4. Rozpocznij przebieg przesiewowy. Ręcznie uruchom przepływ buforu startowego (100 %B) z prędkością 1 ml/minute. Naciśnij start na sterowniku rozdzielacza, aby rozpocząć podział strumienia eluatu w stosunku 90%-10% odpowiednio pomiędzy kolektorem frakcji w probówkach hodowlanych 12 ml (Pozycja 1) a kolektorem frakcji w płytce 96-dołkowej (Pozycja 2). Uwaga techniczna: Należy pamiętać, że kolektor frakcji w płytce 96-dołkowej jest obsługiwany offline względem oprogramowania BioLogic.
5. Uruchom program metody. Natychmiast po rozpoczęciu przebiegu programu metody naciśnij start na ekranowym panelu sterowania offline'owego kolektora frakcji w płytce 96-dołkowej. Jeśli dwa kolektory frakcji nie są w 100% zsynchronizowane, ręcznie przesuń offline'owy kolektor frakcji w płytce 96-dołkowej w momencie, gdy drugi kolektor frakcji przechodzi do drugiej probówki zbierającej frakcję.
6. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry przebiegu. Ciśnienie wsteczne, przewodność i %B (Rycina 4) to parametry przebiegu, które można monitorować w celu zapewnienia powtarzalności warunków przebiegu między kolumnami. Należy również monitorować pozycjonowanie zaworów, pH oraz załadunek próbki. Można porównać zapisy UV, aby zweryfikować podobne piki elucji przepływowej.
7. Wykorzystaj techniki analizy eluatu w linii oraz po zakończeniu przebiegu, aby zidentyfikować profil elucji i stopień oczyszczania interesującego białka (tj. „białka docelowego”).
8. W przypadku próbek zawierających GFP obserwuj elucję w linii, wykorzystując unikalną absorbancję UV białka przy 397 nm. Porównaj zapis absorbancji specyficznej dla GFP przy 397 nm z ogólnym zapisem absorbancji białek przy 280 nm, aby oszacować względną separację i oczyszczanie przy użyciu różnych testowanych mediów HIC (Rycina 5).
9. Analiza GFP i innych białek docelowych po przebiegu może zostać przeprowadzona za pomocą wielu metod. Alikwoty 5-50 μl z frakcji w płytce 96-dołkowej można przenieść na nową płytkę i poddać analizie pod kątem zawartości specyficznego białka metodą ELISA lub western blot, a całkowitą zawartość białka w każdej frakcji można przeanalizować za pomocą konwencjonalnego SDS-PAGE lub mikrofluidycznego systemu elektroforezy Experion. Fluorescencję GFP można wykryć w probówkach hodowlanych 12 ml przy użyciu światła UV (Rycina 6).
10. Identyfikację najbardziej obiecujących mediów HIC można przeprowadzić poprzez porównanie elucji GFP w stosunku do innych białek zawartych w próbce. Oczyszczanie przy użyciu najbardziej obiecujących mediów HIC można następnie zoptymalizować pod kątem innych parametrów, w tym rodzaju i stężenia buforu startowego oraz pH.
11. Uwaga techniczna: Po zakończeniu eksperymentu umieść wszystkie linie wlotowe w Buforze B1 (odgazowane H₂O) i dokładnie wypłucz pompy, zawory oraz wszystkie przewody wodą. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi czyszczenia i długoterminowego przechowywania systemu chromatograficznego i kolumn HIC.

6. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny gradient soli HIC, przewodność oraz ciśnienie kolumny podczas serii próbnych przedstawiono na Rysunku 4. Zmiana stężenia soli (linia niebieska), mierzona jako procent buforu pobieranego z linii buforów o wysokim zasoleniu, jest typowa dla metodologii HIC. W miarę zmniejszania stężenia soli białka związane z kolumną ulegają elucji. Przewodność (linia czerwona), która odpowiada obserwowanemu stężeniu soli, jest mierzona w układzie bezpośrednio za detektorami QuadTec i UV. Przesunięcie między zapisem gradientu soli a przewodnością wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu z wlotu buforu, przez system, aż do monitora przewodności. Przez cały czas trwania analizy próbki ciśnienie systemu (linie szare) i pH pozostają względnie stałe.

Rysunek 5 przedstawia chromatogramy z sekwencyjnych prób badawczych kolumny HIC. Detekcja on-line całkowitego białka (A₂₈₀, linia niebieska) oraz GFP (A₃₉₇, linia zielona) odbywa się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nm i 397 nm. Porównując obie linie, można oszacować względną zawartość GFP oraz stopień rozdziału dla każdego przebiegu badawczego. GFP wiązało się z testowanymi kolumnami HIC z różnym stopniem powinowactwa, a jego profil elucji uległ zmianie. Wybór preferowanej kolumny HIC do przyszłych oczyszczeń opiera się na zidentyfikowaniu kolumny, która generuje najwęższy pik elucji GFP i zapewnia największy rozdział od pozostałych białek.

Na Ryc. 6 przedstawiono probówki z hodowlami dla frakcji 10, 12, 14, 16 i 18 z wstępnego procesu filtracji w fazie odwróconej (FF) fenylu (wysoka podfrakcja), wizualizowane w świetle pokojowym (świetlówki) oraz w świetle ultrafioletowym (UV). Probówki oglądano zarówno od przodu (panele lewe), jak i z góry (panele prawe), aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisji GFP. GFP (kolor zielony) jest wyraźnie widoczna w frakcji 14 na obu obrazach UV. Te dane uzyskane po zakończeniu procesu dobrze korelują z detekcją GFP w trybie on-line, przeprowadzoną poprzez pomiar absorbancji eluatu przy 397 nm (A₃₉₇, linia zielona), która również wskazuje frakcję 14 jako zawierającą główny pik eluowanego GFP. Rozproszone niebieskie światło na lewym panelu UV jest światłem emitowanym przez lampę UV.

Rysunek 1. Schematyczny przedstawienie protokołu. Przygotowano lizat bakteryjny zawierający białko docelowe (GFP, białko docelowe), rozcieńczono go w buforze o wysokim stężeniu soli, odpowiadającym buforowi startowemu do chromatografii, a następnie przefiltrowano. Po przygotowaniu systemu do chromatografii cieczowej wprowadzono próbkę, a białko docelowe oddzielono od pozostałych białek zawartych w lizacie przy użyciu hydrofobowego medium chromatograficznego znajdującego się w gotowej kolumnie HIC. Metodę rozdzielania powtórzono kilkukrotnie, stosując różne media chromatograficzne (tzw. column scouting), aby ustalić, które z nich zapewnia najlepsze rozdzielenie GFP. Eluowane białka (eluat) analizowano w trybie in-line za pomocą detektorów wbudowanych w system chromatograficzny i zbierano w mniejsze frakcje do późniejszej analizy (post-run). Na podstawie analizy in-line i post-run aktywności oraz rozdzielenia GFP wybrano optymalną kolumnę HIC oraz medium chromatograficzne.

Tabela 1. Kluczowe komponenty systemu chromatograficznego użyte w tym protokole.

Rysunek 2. Schemat zastosowanego systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej Bio-Rad DuoFlow. Główne cechy systemu obejmują zautomatyzowane mieszanie buforów, ładowanie próbki do sekwencyjnych przebiegów kolumnowych, automatyczny wybór różnych kolumn chromatograficznych, analizę eluatu w układzie in-line oraz tandemowe zbieranie frakcjonowanego eluatu. Szczegóły znajdują się w tekście i w Tabeli 1.

Tabela 2. Charakterystyka biofizyczna przetestowanych wypełnień HIC. Nazwa kolumny HiTrap HIC wskazuje na rodzaj ligandu, gęstość ligandów oraz rozmiar kulek.

*FF = szybki przepływ (fast flow); HP = wysoka wydajność (high performance). Większy rozmiar kulek zwiększa pojemność wiązania ligandów i szybkość przepływu. Mniejszy rozmiar kulek zwiększa rozdzielczość chromatograficzną. Informacje pochodzą z literatury dostarczonej przez producenta.

Rysunek 3. Połączenie kolumny GE Healthcare HiTrap HIC z systemem Bio-Rad DuoFlow. Do górnej nakrętki i tulejki Delrin 1/4-28 (A1) podłączono złączkę Luer (męska) na 1/4-28 (żeńska) (B1) oraz złączkę 1/16" (męska) na Luer (żeńska) (C). Złączki zostają przymocowane do kolumny HiTrap po przepłukaniu jej buforem i usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza. Wylot kolumny jest połączony z złączką 1/16" (żeńska) na M6 (męska) (D), złączką Luer (męska) na M6 (żeńska) (E) oraz złączką Luer (żeńska) na 1/4-28 (żeńska) (B₂). Cały ten zestaw jest połączony z dolną nakrętką i tulejką Delrin 1/4-28 (A₂). Górny panel przedstawia złączki w rozdzieleniu, a dolny panel przedstawia złączki po montażu.

Krok nr	Objętość (mL)	Opis	Parametry
1	0.00	Zbieranie frakcji 1.0 mL podczas całego przebiegu
2	0.00	Przełączenie kolumn	Kolumna HIC 1 (Pozycja 2)
3	0.00	Przepływ izokracyjny	pH: 6.80 100% B	Objętość: 2.00 mL Przepływ: 1.00 mL/min
4	2.00	Zerowanie linii bazowej	QuadTec
5	2.00	Zerowanie linii bazowej	Detektor UV
6	2.00	Wstrzyknięcie próbki	Załadunek próbki Pętla dynamiczna	Zawór automatycznego wtrysku Objętość: 0.50 mL Przepływ: 1.00 mL/min
7	3.00	Przepływ izokracyjny	pH: 6.80 100%B	Objętość: 5.00 mL Przepływ: 1.00 mL/min
8	8.00	Gradient liniowy	pH: 6.80 100%B -> 0%B	Objętość: 10.00 mL Przepływ: 1.00 mL/min
9	18.00	Przepływ izokracyjny	pH: 6.80 0%B	Objętość: 3.00 mL Przepływ: 1.00 mL/min
10	21.00	Przepływ izokracyjny	pH: 6.80 100%B	Objętość: 5.00 mL Przepływ: 1.00 mL/min
11	26.00	Przełączenie kolumn	Złącze (Union) (Pozycja 1)
Koniec	26.00	Koniec protokołu	Powtarzane automatycznie z 5 dodatkowymi kolumnami HIC (Pozycje 3-7)
Typ skanowania		Liczba przebiegów: 6	Liczba przeskanowanych kroków: 1

Tabela 3. Protokół oprogramowania BioLogic dla zastosowanej metody poszukiwania HIC.

Rysunek 4. Reprezentatywny gradient soli HIC, przewodność i ciśnienie w kolumnie. Wraz ze spadkiem stężenia soli (linia niebieska) spada również przewodność (linia czerwona). Przesunięcie między zapisami gradientu soli a przewodnością wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu z wlotu bufora do monitora przewodności. Ciśnienie systemu (linie szare) pozostaje stosunkowo stałe przez cały czas trwania próbnego rozdzielenia.

Rysunek 5. Zbiorcze chromatogramy z sekwencyjnych prób optymalizacyjnych na kolumnach HiTrap HIC. Detekcja online całkowitego białka (A₂₈₀, linia niebieska) oraz GFP (A₃₉₇, linia zielona) jest realizowana poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nm i 397 nm. W tej serii doświadczeń najostrzejszy pik elucji GFP zaobserwowano przy użyciu kolumny Phenyl FF (high sub). Kolumna Phenyl FF (high sub) wydawała się również zapewniać największe rozdzielenie GFP od pozostałych białek. Dodatkowe przetestowane kolumny HiTrap HIC o objętości 1 ml obejmowały Phenyl fast flow o niskim stopniu podstawienia (Phenyl FF (low sub)), butyl fast flow (butyl FF), butyl-S fast flow (butyl-S FF) oraz octyl fast flow (octyl FF).

Rysunek 6. Reprezentatywna wizualizacja GFP w eluate próbki po zakończeniu procesu. Frakcje eluate były zbierane w tempie 1/minutę, a następnie każda z nich była analizowana pod kątem zawartości GFP. Na tym reprezentatywnym rysunku probówki z frakcjami 10, 12, 14, 16 i 18 z serii rozpoznawczej Phenyl FF (wysokie podstawienie) zostały zobrazowane w świetle pokojowym (fluorescencyjnym) oraz w świetle ultrafioletowym (UV). Probówki oglądano zarówno od przodu (panele lewe), jak i z góry (panele prawe). Rozproszony kolor niebieski na lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV. GFP (zielony) jest wyraźnie wykrywalny w frakcji 14 na obu obrazach UV. Górny panel przedstawia zapisy chromatogramów całkowitego białka (A280, linia niebieska) i GFP (A₃₉₇, linia zielona) dla pięciu wizualizowanych frakcji.

Dyskusja

Techniki chromatografii cieczowej okazały się nieocenione w przygotowywaniu wysoko oczyszczonych białek niezbędnych do prowadzenia badań immunologicznych ⁶, biochemicznych ⁷ oraz strukturalnych ⁸. Metody oczyszczania za pomocą HIC najczęściej wymagają empirycznego wyznaczenia optymalnego medium, a wykazano, że na wyniki chromatograficzne wpływają struktura ligandu, gęstość ligandu oraz właściwości kulek matrycy ^{2, 3}. Zautomatyzowany dobór kolumny (column scouting) jest efektywnym podejściem do wyboru medium HIC do późniejszej optymalizacji i oczyszczania białek ⁴. Przedstawiona metoda zautomatyzowanego doboru kolumn może być łatwo dostosowana do różnych strategii oczyszczania białek metodą HIC. Warunki oczyszczania mogą zostać dodatkowo ulepszone poprzez zmiany stężenia soli, wybór rodzaju soli, gradientu soli oraz pH, a wpływ tych kluczowych parametrów został omówiony w poprzednich przeglądach ^13,14. Eluat HIC zawierający częściowo oczyszczone białko docelowe może zostać poddany dalszemu oczyszczaniu przy użyciu komplementarnej techniki chromatograficznej, takiej jak chromatografia wymiany jonowej (IEX) lub filtracja żelowa/chromatografia wykluczaniaC ^9,10.

Ze względu na unikalne charakterystyki absorpcji i emisji światła, profil elucji GFP można zidentyfikować, stosując podejścia in-line oraz post-run. W tym celu niniejszy protokół można dalej dostosować do oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych z GFP, w których niepowiązane białko docelowe jest „oznaczone” GFP. Białka docelowe oznakowane GFP mogą być wykrywane za pomocą światła UV ¹¹ i oczyszczane przy użyciu różnych metod chromatograficznych, w tym opisanej powyżej strategii oczyszczania HIC. Oczyszczanie GFP stało się również stałym elementem dydaktycznym w laboratoriach biochemicznych, służącym do nauczania nowoczesnych technik nauki o białkach ¹².

Choć podstawowa puryfikacja białek metodą HIC może być przeprowadzona przy użyciu znacznie mniej zaawansowanego systemu chromatograficznego, instrumentarium przedstawione w niniejszym opracowaniu oferuje szereg wyraźnych zalet ułatwiających uzyskanie korzystnych wyników. Do istotnych korzyści płynących z wykorzystania systemu wysoko zautomatyzowanego należą: lepsza powtarzalność warunków między poszczególnymi przebiegami, oszczędność czasu oraz mniejsze ryzyko wprowadzenia powietrza do układu ¹⁰. Sterowane systemowo mieszanie buforów, realizowane przez moduł maximizer, pozwala na zwiększenie spójności przygotowania buforów oraz powtarzalności eksperymentalnej. Pobranie wystarczającej ilości próbki do dynamicznej pętli próbkowej na wszystkie przebiegi wstępne (scouting runs) zapewnia dodatkowo jednorodność próbki wprowadzanej na każdą kolumnę i umożliwia sekwencyjne uruchamianie analiz bez przerw lub konieczności ręcznego ponownego ładowania. Kontrolowany wtrysk próbki z pętli na kolumnę zmniejsza zmienność, która może wystąpić podczas ręcznego nakładania próbki. Para zaworów wyboru kolumny pozwala na następujące po sobie przebiegi z użyciem różnych kolumn HIC bez konieczności ponownego łączenia przewodów w systemie. Analiza wielodługościowa jest szczególnie korzystna podczas badania białek o unikalnym profilu spektrofotometrycznym. Poza GFP, techniką tą mogą odnieść korzyść cytochromy, flawoproteiny oraz inne białka zawierające hem. Urządzenia do monitorowania przewodnictwa i pH pozwalają na weryfikację warunków eksperymentalnych w czasie rzeczywistym. Rozdzielczy system zbierania frakcji eluatem pozwala na lepszą obsługę frakcji i umożliwia łatki transfer do metod analizy po-runowej wymagających minimalnej objętości próbki (np. ELISA, SDS-PAGE, western blot oraz mikroprzepływowa elektroforeza Experion). Chociaż obsługa drugiego kolektora frakcji w trybie offline wymaga ręcznej synchronizacji, zapewnia ona maksymalną elastyczność w wyborze kolektora. Najistotniejszymi wadami wykorzystania tak zaawansowanego systemu chromatograficznego do doboru kolumny HIC i puryfikacji białek są początkowe nakłady czasu i funduszy związane z zakupem instrumentu oraz szkoleniem operatora.

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje system chromatograficzny Bio-Rad DuoFlow; jednak można również zastosować równie wydajną aparaturę od innych producentów, taką jak ÄKTA Avant firmy GE Healthcare, która pozwala na uzyskanie równoważnych wyników. Nawet porównywalne systemy chromatograficzne posiadają unikalne cechy (np. programowanie metod, nomenklaturę komponentów, preferencje operatora oraz ograniczenia w zakresie skalowalności), które należy wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem procedury oczyszczania lub zakupem urządzenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System BioLogic DuoFlow Pathfinder 20	Bio-Rad	7602257	Obejmuje: system maximizer, mieszalnik, stację roboczą F10, zawór AVR7-3, detektor UV/Vis QuadTec z celą przepływową, kolektor frakcji BioFrac, oprogramowanie BioLogic oraz zestaw startowy
Zawór wyboru strumienia AVR9-8	Bio-Rad	7600408
Zawór przekierowujący SV3-2	Bio-Rad	7500410
Zawór rozdzielający strumień	Bio-Rad	7410017
Zestaw DynaLoop 25	Bio-Rad	7500451
Kolektor frakcji BioFrac	Bio-Rad	7410002	Użyto dwóch kolektorów frakcji
Adapter głowicy kroplującej do mikropłytek BioFrac	Bio-Rad	74010088
Adapter do płytek mikrotitracyjnych BioFrac	Bio-Rad	7410017
Moduł optyki UV	Bio-Rad	7500202
Lampa halogenowa	Bio-Rad	7601331
Pompa gradientowa Econo	Bio-Rad	7319001
System Experion	Bio-Rad	7007001
Zestaw analityczny Experion Pro260	Bio-Rad	7007102
Zestaw do wyboru kolumn HiTrap HIC	GE Healthcare	28-4110-07	Obejmuje 7 x 1 ml wstępnie napełnionych kolumn z wypełnieniem HIC do celów screeningowych
Złączki kolumn GE Healthcare do Bio-Rad	GE Healthcare	18111251 i 18111257