$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Schematyczny przebieg metody jest opisany na rysunku 1.
1. Przygotowanie materiału
UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki aseptycznie w sterylnym kapturze, a następnie podziel i przechowuj we wskazanej temperaturze. Odczynniki można przechowywać do 2 lat bez utraty ich działania.
- Przygotować CFA zawierające 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis zgodnie z poniższym opisem.
- Dodać 100 mg liofilizowanego M. tuberculosis H37RA (patrz tabela materiałów) i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 mm do probówki o pojemności 7 ml (patrz tabela materiałów). Potrząsaj probówką w homogenizatorze (patrz tabela materiałów) przez 60 s przy najwyższym ustawieniu prędkości (5 000 obr./min).
- Dodać 5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda (IFA) do probówki i ponownie wstrząsać przez 60 s z najwyższą prędkością. Przenieść zawiesinę homogenizowanego M. tuberculosis z IFA (obecnie pod nazwą CFA) do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Do liofilizowanego proszku peptydu MOG35-55 (patrz tabela materiałów) dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcowe stężenie peptydu 10 mg/ml. Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przygotować 60 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
nuta: Peptyd MOG35-55 użyty w tym eksperymencie ma czystość ImmunoGrade (~70%), jest rozszczepiony TFA, łatwo rozpuszcza się w wodzie i zawiera C-końcowy amid (-NH2) w celu zwiększenia stabilności in vivo. Podwielokrotności peptydów nigdy nie były rozmrażane i ponownie zamrażane więcej niż dwa razy i były przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
2. Przygotowanie emulsji CFA/peptydowych
- Obliczyć ilość emulsji potrzebną do immunizacji. W tym standardowym protokole każda mysz otrzymuje 50 μg peptydu MOG35-55 i 300 μg M. tuberculosis rozproszone w adiuwantzie Freunda (CFA). Ilość każdego odczynnika (peptyd MOG35-55, PBS, CFA i IFA) wymagana do przygotowania emulsji może być obliczona za pomocą pliku uzupełniającego 1. Dodatkowe 20% wszystkich odczynników, aby zrekompensować niewielki ubytek emulsji, jest uwzględniane w obliczeniach.
nuta: Dostępny w handlu zestaw emulsji (patrz tabela materiałów) użyty w tym badaniu składa się z tubki, nakrętki i tłoka w wysterylizowanej torebce. Każda tubka zestawu emulsji mieści maksymalnie 9,6 ml, co umożliwia przygotowanie 8 strzykawek o pojemności 1 ml wystarczających do zaszczepienia 40 myszy (lub 80 myszy w przypadku użycia 100 μl emulsji na zwierzę).
- Umieść zakręcaną rurkę (z dostępnego w sprzedaży zestawu emulsji) i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie.
- Dodać składniki emulsji w następującej kolejności w objętościach obliczonych w kroku 2.1: PBS, następnie peptyd, następnie M. tuberculosis w CFA, a na końcu IFA.
- Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5-10 s, aby wstępnie wymieszać odczynniki.
- Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 s. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na 3 minuty. Powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.
- Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję.
- Zdjąć nakrętkę z tubki, włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji. Zdejmij zatrzaskiwane zamknięcie na dole tuby, przekręcając je.
- Wyjąć tłok ze strzykawki do wstrzykiwań (1 ml; patrz Tabela materiałów). Dodać igłę (najlepiej 25-27 G) do strzykawki do wstrzykiwań.
- Przymocować tylny koniec strzykawki do przeznaczonego do tego celu zamka w dolnej części rurki i zablokować go krótkim przekręceniem.
- Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Przerwać, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 ml strzykawki do wstrzykiwań.
- Oddzielić strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby do strzykawki nie dostało się powietrze. Naciskać tłok tak długo, aż emulsja wyjdzie z igły.
nuta: W tym momencie część emulsji można wykorzystać do kontroli jakości (patrz krok 3).
- Powtórz kroki 2.8-2.11 dla reszty emulsji obecnej w probówce.
nuta: Aby zminimalizować marnotrawstwo drogich emulsji CFA/antygenowych, należy używać strzykawek o pojemności 1 ml. Można użyć innych strzykawek, które pasują do dedykowanego zamka na dnie tuby; Jednak może być konieczne przygotowanie większej objętości emulsji. Emulsja peptydowa CFA/MOG35-55 może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 15 tygodni bez utraty zdolności indukowania EAE.
3. Kontrola jakości emulsji
- Test kroplowy: Dodaj małą kroplę emulsji do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml zimnej wody. Zamknij tubkę i potrząsaj nią ręcznie przez kilka sekund. Pojawienie się maleńkich, wyraźnych kropelek potwierdza tworzenie się emulsji typu woda w oleju.
- Zbadaj emulsję za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
- Aby przeanalizować wielkość cząstek wody w oleju, dodaj niewielką kroplę (2-3 μl) emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję.
- Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym (patrz tabela materiałów) z 400-krotnym powiększeniem i skoncentruj się na polu z monowarstwą emulsji. Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite szaro-białe cząstki (rysunek 2A).
