Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy
UWAGA: Poniższa procedura, obejmująca przygotowanie zwierząt i operację, zajmie 30-40 minut. Przed zabiegiem włącz mikroskop i rozgrzej dołączony inkubator na mikroskopie do 37 °C.
- Wykonaj eksperymenty na 8-10 tygodniowych myszach TcrdEGFP na tle C57BL / 6, które uzyskano od Bernarda Malissena (INSERM, Paryż, Francja). Zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC, znieczulenie myszy poprzez wstrzyknięcie ip ketaminy (120 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) w zależności od masy ciała zwierzęcia. Oceń poziom znieczulenia na podstawie częstości oddechów (55-65 oddechów na minutę), szczypania palców u nóg i odruchu powiekowego.
- Po osiągnięciu znieczulenia w płaszczyźnie operacyjnej przymocuj tylne nogi myszy za pomocą taśmy do poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała, którą można monitorować za pomocą termometru doodbytniczego. Jeśli pojawią się oznaki, że znieczulenie słabnie (np. przyspieszone oddychanie, mruganie i/lub drganie mięśni oka w odpowiedzi na odruch powiekowy), należy ponownie podawać 50 μl ketaminy/ksylazyny na raz, aż mysz zostanie całkowicie uspokojona.
- Przygotować barwnik jądrowy, rozcieńczając 50 μl Hoechst 33342 (10 mg/ml) 315 μl 0,9% soli fizjologicznej; końcowe stężenie wynosi 37,5 mg/kg w przeliczeniu na masę myszy (przybliżona objętość 200 μl). Po znieczuleniu myszy powoli wstrzyknąć Hoechst za pomocą strzykawki tuberkulinowej przez zatokę żylną zadoczodołową.
UWAGA: Odczekaj 1–2 minuty przed przejściem do następnego kroku, aby umożliwić myszy przyzwyczajenie się do zmiany objętości krążącej po wstrzyknięciu retroorbitalnym.
- Nałóż niewielką ilość lubrykantu na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.
2. Chirurgia na myszach: laparotomia w celu odsłonięcia błony śluzowej jelit
- Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2 cm przez skórę i otrzewną wzdłuż linii środkowej dolnej części brzucha, aby uzewnętrznić obszar jelita, który ma być zobrazowany.
- Za pomocą kleszczy pod kątem ostrożnie wyciągnij jelito ślepe z jamy otrzewnej i zidentyfikuj obszar jelita cienkiego, który ma być zobrazowany. Uważaj, aby podczas tego procesu nie rozerwać naczyń krwionośnych krezki. Aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia lub krwawienie, unikaj chwytania lub szczypania jelita kleszczami.
- Zlokalizuj odpowiedni obszar jelita cienkiego (2–3 cm) do obrazowania, który zawiera minimalną zawartość kału. Ostrożnie włóż jelito ślepe i pozostałe jelito cienkie do jamy otrzewnej, pozostawiając interesujący nas segment uzewnętrzniony.
UWAGA: Na tym etapie należy unikać nakłuwania jelita ślepego lub przerywania naczyń krwionośnych krezki.
- Umieść dwie pary kleszczy po obu stronach leżącej poniżej krezki między naczyniami krwionośnymi i delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie (ryc. 1). Umożliwi to przejście igły przez krezkę podczas zamykania jamy otrzewnej pod jelitem.
- Zamknij nacięcie, zachowując uzewnętrznienie pętli jelita. Za pomocą kleszczy kątowych i zakrzywionej, stożkowej igły przymocowanej do 5-centymetrowego szwu wbij się z jednej strony otrzewnej, przejdź przez otwór wykonany w poprzednim kroku i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej. Umieść jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dolnej części nacięcia.
UWAGA: Na tym etapie unikaj uszkadzania naczyń krwionośnych.
- Powtórz ten proces, aby zamknąć skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew w środku nacięcia, między poprzednimi szwami w leżącej poniżej otrzewnej.
UWAGA: Ważne jest, aby uzewnętrzniać tylko obszar, który ma być obrazowany; Zmniejszy to obcy ruch podczas obrazowania. Pamiętaj, aby unikać wiązania tętnic krezkowych.
- Użyj elektrokoagulacji, aby wykonać linię perforacji wzdłuż granicy antykrezkowej. Natychmiast po kauteryzacji nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem. Osusz chusteczką Kimwiste, aby usunąć resztki wody.
- Wytnij małą poziomą szczelinę na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki za pomocą nożyczek Vannas i przystąp do cięcia wzdłuż długości kauteryzowanej linii w kierunku bliższego końca zewnętrznego segmentu tkanki (około 1,5 cm długości), aby odsłonić powierzchnię błony śluzowej.
UWAGA: W razie potrzeby użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć nadmiar kału pozostałego na odsłoniętej powierzchni błony śluzowej.
- Przykryj brzuch myszy wilgotnym Kimwiste, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. Przenieś mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu.
3. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem
- Odpipetować 150 μl 1 μM AlexaFluor 633 w HBSS na szklany, nasunięty spód naczynia o średnicy 35 mm. Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym.
- Przechyl głowicę mikroskopu do tyłu i umieść mysz na nakrytej czaszy na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Alternatywnie przykryj mysz kocem grzewczym, aby utrzymać temperaturę ciała.
- Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Intensywność wzbudzenia i czas naświetlania dla każdego lasera nie powinny przekraczać odpowiednio 10–15 mW lub 120–150 ms, aby uniknąć fotowybielania i zminimalizować odstęp między punktami czasowymi. Ustaw średnią klatek na "2" i włącz funkcję wzmocnienia EM, aby zredukować szumy tła. Wybierz kalibrację obiektywu 63x, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela.
UWAGA: Opisane powyżej ustawienia mają na celu zapewnienie początkowego odniesienia, ale będą się różnić w zależności od indywidualnych konfiguracji mikroskopu.
- Korzystając z lasera 405 nm i obiektywu pneumatycznego 20x, wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfują okiem. Unikaj obszarów sztucznych ruchów spowodowanych oddychaniem, perystaltyką jelit lub biciem serca.
- Za pomocą skanu XY zapisz współrzędną XY pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu.
- Upewnij się, że kosmki w wybranym polu są stabilne, uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm przez maksymalnie 1 minutę.
- Uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm, dostosuj ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmków. Uzyskaj stosy Z, zaczynając tuż pod nabłonkiem końcówki kosmka w dół kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra, około 15–20 μm, co 1,5 μm.
UWAGA: W przypadku obrazowania z trzema kanałami (405, 488, 640 nm) przy użyciu opisanych powyżej czasów naświetlania, możliwe jest sekwencyjne rejestrowanie wszystkich trzech kanałów w odstępach około 20 s.
- Otwórz oprogramowanie w trybie analizy, 3–5 minut po rozpoczęciu akwizycji, aby potwierdzić stabilność obrazu i ruchliwość γδ IEL. Kontynuuj zbieranie obrazów przez 30–60 minut dla każdego pola kosmków. Zapisz 2–3 pola dla każdej myszy. Podczas obrazowania monitoruj mysz co 5 minut.
