$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Produkcja i charakterystyka LMP
UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu, upewnij się, że wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są sterylne lub autoklawowane. Wszystkie czynności w RT należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, chyba że wskazano inaczej.
- Stymulacja i zbieranie posłów
- Rozmrozić podwielokrotność 10 milionów limfocytów T CEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć w 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki krwiotwórczej bez surowicy, takiej jak X-VIVO, w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować w czasie 200 g x 5 min. Odessać komórki supernatantu i ponownie zawiesić je w 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża.
- Przenieść komórki do kolby do hodowli tkankowej T75 (do komórek zawiesinowych) z 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki krwiotwórczej, takiej jak X-VIVO, i inkubować przez 4 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Po 4 dniach przenieść całą pożywkę hodowlaną i komórki do kolby do hodowli tkankowej T175 zawierającej 100 ml świeżej pożywki. Kontynuuj inkubację komórek przez około 72 godziny w tych samych warunkach, aż osiągną gęstość 2 milionów komórek/ml.
- Równomiernie podzielić komórki między cztery kolby T175, z których każda zawiera 150 ml świeżej pożywki i kontynuować hodowlę komórkową, aż komórki urosną (około 48 godzin inkubacji) do gęstości 2 milionów/ml.
- Zebrać komórki z każdej kolby przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić 300 x 106 komórek w nowej kolbie T175 zawierającej 150 ml świeżej pożywki, w celu utrzymania gęstości komórek 2 miliony/ml.
- Dodać aktynomycynę D (rozpuszczoną w DMSO w stężeniu 2 mg/ml) do pożywki w końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i inkubować przez 24 godziny.
- Przenieść całą pożywkę hodowlaną do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować komórki przy 750 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 500 x g przez 15 minut w celu usunięcia dużych fragmentów komórek.
- Przenieść sklarowany osad do butelki o pojemności 250 ml i ultrawirować przy 12 000 x g przez 50 minut. Odrzucić supernatant i zebrać granulki.
- Przemyć granulki wzbogacone LMP 40 ml sterylnego PBS w probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 50 min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
- Zebrać ostatni supernatant do przemywania i będzie on używany jako element sterujący pojazdu. Zawiesić granulki LMP w 1 ml PBS i przenieść je do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Podziel i przechowuj izolowane LMP w temperaturze -80 °C (aby uniknąć wielu cykli swobodnego rozmrażania).