$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wzbogać specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8+ za pomocą przygotowanych nanocząsteczek sztucznych komórek prezentujących antygen.
- Wyizoluj limfocyty T CD8 +.
- Poddaj zwierzęta eutanazji poprzez wystawienie na działanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
- Usuń śledzionę i węzły chłonne z myszy C57BL / 6j typu dzikiego i umieść je w roztworze PBS. Macerować narządy i eluować komórki przez sterylne sitko do komórek o średnicy 70 μm z częstym płukaniem PBS.
- Aby wyeliminować limfocyty T inne niż CD8+, użyj bezdotykowego zestawu do izolacji limfocytów T CD8+ i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Każdy warunek antygenowy wymaga co najmniej 3 x 106 limfocytów T CD8 +.
- Dodaj nanocząstki aAPC, aby związać się z limfocytami T CD8 +.
- Po izolacji skoncentrować do objętości 100 μl w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA.
- Określ liczbę aAPC do dodania, obliczając na podstawie stosunku 1011 związanych z aAPC, załadowanych peptydami MHC-Ig na każde 106 limfocytów T CD8 +.
- Inkubować cząstki APC i limfocyty T CD8+ przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z ciągłym mieszaniem w sterylnej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu.
- Przygotuj uzupełnione pożywki i czynnik wzrostu limfocytów T (TCGF) do elucji i hodowli limfocytów T CD8 +.
- W przypadku pożywek uzupełniających, uzupełnij kompletną pożywkę RPMI 1640 (z glutaminą) w 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronianu sodu, 0,4x roztwór witaminy, 92 μM 2-merkaptoetanol, 10 μM cyprofloksacyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Aby utworzyć TCGF, postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami.
nuta: TCGF to autorski koktajl ludzkich cytokin odpornościowych, który jest niezbędny do zapewnienia limfocytom T dodatkowych sygnałów stymulacyjnych potrzebnych do wzrostu. TCGF można wymienić na znane cytokiny stymulujące limfocyty T, takie jak IL-2, IL-7 lub IL-15; jednak każdy z nich może odpowiednio spolaryzować odpowiedź limfocytów T.
- Umyj i wzbogac mieszaninę limfocytów T APC i CD8+.
- Przemyć cząstki magnetyczne aAPC, najpierw używając buforu PBS z 0,5% BSA i 2 mM EDTA, następnie używając pożywki z dodatkiem i trzeciej przy użyciu pożywki z dodatkiem 1% TCGF.
- Elute aAPC i wzbogacone limfocyty T CD8+ w 500 μl pożywki z dodatkiem 1% TCGF.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki na płytce z dnem 96 w kształcie litery U w 160 μl na studzienkę pożywki z dodatkiem 1% TCGF w stężeniu 2,5 x 105 limfocytów T CD8 + / ml.
- W przypadku izolacji za pomocą aAPC z tylko peptydowym MHC-Ig na powierzchni (brak sygnałów kostymulujących), wykonaj krok 4.5. W przypadku izolacji za pomocą aAPC z zarówno MHC-Ig załadowanym peptydami na powierzchni, jak i sygnałami kostymulującymi, przejdź do kroku 5.
- Dodaj cząstki magnetyczne pokryte sygnałami kostymulującymi na powierzchni do wzbogaconej frakcji i dodaj pole magnetyczne, aby skupić sygnały stymulujące na powierzchni limfocytów T.
- Do wzbogaconych frakcji dodać równomolowe (lub większe w zależności od zastosowania - patrz rozdział o właściwościach aAPC do kontroli) przeciwciało stymulujące do liczby MHC-Ig obciążonych peptydami na cząstce.
- Pozwolić, aby kostymulujące cząstki magnetyczne związały się ze wzbogaconymi limfocytami T CD8 + przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Dodaj pole magnetyczne, umieszczając płytkę hodowlaną między dwoma neodymowymi magnesami dyskowymi N52 o długości 1,9 cm (0,75 cala).
nuta: Magnesy dyskowe N52 mają niezwykle silne pole. Należy zachować ostrożność zarówno przy przechowywaniu ich z przekładkami między magnesami, ponieważ trudno jest je wyjąć z siebie podczas umieszczania ich na płytkach hodowlanych. Aby zminimalizować przywieranie magnesów do metalowych elementów inkubatora, umieść je w stożkowych pojemnikach styropianowych o pojemności 50 ml zarówno na dole, jak i na górze.
2. Rozszerzanie i wykrywanie specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ za pomocą przygotowanych nanocząsteczek sztucznych komórek prezentujących antygen
- Dodać 96 płytek studzienkowych z dnem w kształcie litery U z APC i limfocytami T CD8 + do nawilżonego inkubatora o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 dni. W dniu 3 nakarmić komórki 80 μl na studzienkę z dodatkami z 2% TCGF i umieścić je z powrotem w inkubatorze do 7 dnia.
- W dniu 7 zbierz stymulowane komórki do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml w celu zliczenia.
- Po zebraniu całego roztworu należy odwirować zebrane komórki w celu ponownego zawieszenia w 0,5 ml PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS. Policz żywe komórki, barwiąc błękitem trypanowym i licząc na hemocytometrze.
- Usuń 50 000-500 000 zliczonych komórek do dwóch nowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml w celu barwienia specyficznego dla antygenu. Jedna probówka zostanie użyta do barwienia pokrewnym peptydem-MHC, a druga rurka zostanie użyta do barwienia niepokrewnego w celu określenia barwienia tła.
- Dodać 1 μg biotynylowanego MHC-Ig do odpowiednich probówek pokrewnych i niepokrewnych w 100 μl PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS ze szczurzym anty-mysim CD8a sprzężonym z allofikocyjaniną (APC), klon 53-6,7 (stosunek rozcieńczenia 1:100) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Dodaj wtórną streptawidynę i żywą martwą plamę. Wypłukać nadmiar biotynylowanego MHC-Ig za pomocą PBS poprzez odwirowanie. Następnie wybarwić wszystkie próbki streptawidyną znakowaną fikoerytryną (PE) w stosunku 1:350 i stosunkiem 1:1000 żywego/martwego, możliwego do utrwalenia zielonego barwnika martwych komórek przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Odczytaj wszystkie próbki na cytometrze przepływowym, aby określić swoistość i liczbę komórek specyficznych dla antygenu.
- Wypłukać nadmiar wtórnych i żywych/martwych plam przez odwirowanie i ponownie zawiesić za pomocą 150 μl buforu PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS do odczytu na cytometrze przepływowym.
- Określ liczbę i procent komórek specyficznych dla antygenu za pomocą oprogramowania do analizy danych.
- Aby określić procent komórek specyficznych dla antygenu, użyj następujących bramek w odpowiedniej kolejności: live+, limphocyty+ (rozpraszanie do przodu przez rozpraszanie boczne), CD8+ i Dimer+. Określ bramkę Dimer+, porównując barwę niepokrewną z pokrewną.
- Określ procent komórek specyficznych dla antygenu w próbce, odejmując procent Dimer+ pokrewnego barwienia MHC-Ig od niepokrewnego barwienia MHC-Ig.
- Korzystając z tego procentu komórek specyficznych dla antygenu, pomnóż go przez liczbę zliczonych komórek, uzyskując liczbę komórek specyficznych dla antygenu powstałą w wyniku wzbogacenia i ekspansji.
nuta: Kompensacja będzie musiała być ustawiona na cytometrze przepływowym, ponieważ występuje nakładanie się widma z fluoroforami używanymi w tym panelu.