Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja PMC przez płukanie dootrzewnowe
- Przed izolacją komórek należy przygotować materiały wymienione w tabeli 1.
- Użyj samców myszy w wieku od 8 do 14 tygodni do izolacji PMC. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 i potwierdź śmierć przez utratę odruchów. Spryskaj mysz 70% etanolem i przymocuj ją do bloku piankowego za pomocą szpilek (grzbietem do dołu). Usuń brzuszną skórę myszy za pomocą nożyczek o krawędziach. Unikać uszkodzenia jamy otrzewnej.
nuta: Zazwyczaj używamy tego protokołu dla myszy z tłem genetycznym szczepu C57BL/6N.
- Wstrzyknąć 7 ml lodowatego podłoża RPMI i 5 ml powietrza do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 27 G. Ostrożnie wbić igłę w otrzewną i nie przebijać żadnych narządów. Użyj miejsca w okolicy tłuszczu najądrza, aby zmniejszyć ryzyko perforacji narządu.
- Po wstrzyknięciu należy potrząsać myszą przez 1 minutę, aby odłączyć komórki otrzewnej od podłoża RPMI. Nie potrząsaj myszą zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych i zanieczyszczenia jamy otrzewnej krwią.
- Ponownie użyj strzykawki o pojemności 10 ml, wyposażając ją w nową kaniulę 20 G. Przesuń narządy wewnętrzne na jedną stronę, przechylając blok piankowy i delikatnie stukając nim o ławkę, aby ułatwić aspirację podłoża z drugiej strony. Włóż igłę 20 G, delikatnie i powoli odessaj płyn z jamy brzusznej (~0,5 ml/s), aby uniknąć zatkania przez narządy wewnętrzne. Zbierz jak najwięcej płynu (zwykle 5–6 ml).
- Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zawiesinę pobranych komórek do probówki pobranej na lodzie. Wyrzuć probówkę z próbką, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwi.
- Odwirować probówki z zawiesiną komórek o sile ~300 x g przez 5 min. Pod sterylnym kapturem odessać supernatant. Dla każdej myszy połączyć osady próbki w 4 ml zimnej (4–10 °C) pożywki PMC i przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej o średnicy 25 cm2. Dodać czynniki wzrostu IL-3 i SCF do końcowych stężeń odpowiednio 10 ng/ml i 30 ng/ml. Umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) i inkubować przez ~48 godzin do następnego zabiegu.
Tabela 1: Materiały do Kroku 1.
| 1 | lód |
| cyfra arabska | Strzykawki 10 ml |
| 3 | Igły 27 G |
| 4 | Igły 20 G |
| 5 | Blok styropianowy i kołki |
| 6 | Probówki zbiorcze (plastikowe probówki wirówkowe 50 ml) |
| 7 | 70% etanolu |
| 8 | RPMI Medium (wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (płodowa surowica cielęca) + 1% roztwór penicyliny Streptomycyny (Pen-Strep) |
| 10 | Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco - DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) |
| 11 | Kolby hodowlane (25 cm) |
| 12 | Roztwory podstawowe czynników wzrostu (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/ml) |
| 13 | Pipety serologiczne (10 ml) |
| 14 | Końcówki do pipet sterylne (20–200 μl) |
| 15 | Hemocytometr |
| 16 | Wirówka stołowa |
| 17 | Nożyczki i kleszcze |
| Rozdział 18 | Komora CO2 dla myszy |
| Rozdział 19 | Otwarty sterylny kaptur |
| 20 | Zamknięty sterylny kaptur |
| 21 | Inkubator komórkowy (37 °C i 5% CO2 ) |
| 22 Rozdział 22 | Pipety transferowe (20–200 μl) |