Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Produkcja urządzeń i litografia miękka
UWAGA: Standardowe techniki miękkiej litografii zostały użyte do stworzenia mikrokanału polidimetylosiloksanu (PDMS).
- Wymieszaj prekursor PDMS w stosunku 10:1 zasady i utwardzacza.
- Wlać 30 g mieszaniny prekursorów PDMS do mikroobrabianej formy aluminiowej (patrz rysunek 1 dla wymiarów) i 20 g mieszaniny prekursorów PDMS do płytki Petriego o średnicy 100 mm.
nuta: Szalka Petriego służy do wytwarzania grubej warstwy PDMS (~3 mm) na warstwę nośną. Warstwa nośna PDMS zapewnia jednolite właściwości fizyczne powierzchni w całej mikrofluidyce. Alternatywnie można użyć cienkiej folii PDMS na szkiełku podstawowym. Forma wzorcowa o określonych wymiarach kanału została zaprojektowana i wykonana metodą mikrofrezowania na blasze aluminiowej. Kanał spiralny zastosowany w tym badaniu był 8-pętlowym spiralnym mikrokanałem z jednym wlotem i dwoma wylotami, o promieniu rosnącym z 8 mm do 24 mm w celu efektywnej separacji opartej na rozmiarze.
- Umieść formę i szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym w celu odgazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne pęcherzyki, zwykle 5 - 10 minut. Użyj odkurzacza domowego do eksykatora.
- Zwolnij próżnię i umieść formę oraz szalkę Petriego w piekarniku o temperaturze 90 °C na 1 godz
nuta: Zamiast piekarnika można użyć płyty grzejnej lub innych narzędzi grzewczych.
- Wyjmij formę i szalkę Petriego z piekarnika i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Ostrożnie wytnij kontur i przebij otwory dostępu do płynów w urządzeniu za pomocą dziurkacza 2 mm.
nuta: Rozmiar stempla może się różnić w zależności od rozmiaru rurki lub prowadnicy płynu.
- Przyklej taśmę do strony kanału urządzenia i grubą warstwę PDMS i ostrożnie odklej kleszczykami, aby usunąć kurz.
- Potraktuj zarówno stronę kanałową urządzenia, jak i zwykły PDMS plazmą powietrzną i połącz z przygotowaną warstwą nośną zwykłego PDMS (rysunek 1A).
- Umieść wiór na szkiełku podstawowym o wymiarach 50 mm x 70 mm i umieść go w piekarniku o temperaturze 70 °C na co najmniej 30 minut, aby zwiększyć siłę wiązania.
2. Pobieranie wydzieliny tchawicy od pacjentów wentylowanych mechanicznie
UWAGA: Wydzieliny tchawicy mogą być uzyskane od pacjentów wentylowanych mechanicznie podczas normalnej, rutynowej pielęgnacji dróg oddechowych, przy użyciu protokołu zmodyfikowanego z konwencjonalnych metod, aby dostosować się do standardowego, dorosłego pacjenta wentylowanego. Próbki zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i natychmiast wysłane do przetworzenia.
- Jeśli wskazana jest aspiracja tchawicy, użyj cewnika do ekstrakcji wydzieliny z dróg oddechowych.
- Ostrożnie przesunąć cewnik do połowy rurki dotchawiczej i wkroplić 5 ml 0,9% sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej z ampułko-strzykawki o pojemności 10 ml.
- Gdy cewnik jest w pełni zaawansowany lub napotkany jest opór, odessać wydzieliny i zebrać je do sterylnego pojemnika do pobierania plwociny.
- Zbierz 10 ml wydzieliny tchawicy do sterylnego pojemnika na plwocinę i umieść go na lodzie. Natychmiast wyślij próbki do przetworzenia.
3. Przygotowanie próbki wydzieliny tchawicy
UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
- Rozproszyć 1 ml próbek wydzieliny z dróg oddechowych w 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml (do 10-krotnego rozcieńczenia). Użyj pipety, aby homogenizować próbkę śluzu.
- Odcedź rozcieńczalnik za pomocą nylonowego sitka komórkowego o wielkości 40 μm, aby usunąć duże kawałki lub skrzepy krwi, które mogą blokować otwór dostępowy do mikroprzepływów lub kanał. Po przetworzeniu umieścić próbkę na lodzie.
- Rozcieńczalnik każdej próbki należy rozcieńczyć przy użyciu 100-krotnie większej objętości buforu PBS, co daje 1,000-krotnie rozcieńczoną zawiesinę. Umieścić próbkę na lodzie podczas całej operacji dysocjacji.
4. Konfiguracja eksperymentalna
UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
- Zmontuj chip PDMS z prowadnicą płynu, aby zapewnić równomierny przepływ do każdego z czterech spiralnych mikrokanałów (Rysunek 1B).
nuta: Wykorzystano cztery kanały w celu zwiększenia przepustowości poprzez zrównoleglenie, a także optymalizacji objętości i gęstości komórek powstałej zawiesiny. Prowadnica płynu została zaprojektowana i wykonana za pomocą stereolitografii drukarki 3D z przezroczystą żywicą. Port wlotowy i wylotowy prowadnicy płynu wykorzystuje żeńskie złącza Luer, co ułatwia podłączanie i stabilne uszczelnienie podczas pracy.
- Podłącz męskie złącze Luer 1/16 cala do wlotu, wylotu ściany wewnętrznej (IW) i portu wylotowego ściany zewnętrznej (OW) prowadnicy płynu i podłącz silikonową rurkę do zawiesiny próbki.
- Włóż końcówki do każdego końca wlotu i wylotu, aby dotrzeć do dna zbiornika na próbkę.
- Połączyć pompę perystaltyczną z rurką wlotową.
- Umieść koniec rurki wlotowej i rurki wylotowej IW w zbiorniku na próbkę, a koniec rurki wylotowej OW umieść w zbiorniku na odpady (Rysunek 1C, D).
- Umieścić 50 ml probówkę z przefiltrowanym PBS bez wapnia i magnezu w zbiorniku na próbkę.
- Rozpocznij pompowanie przy niskim natężeniu przepływu (~1 ml/min), aby zalać urządzenie.
nuta: Gdy pęcherzyki zostaną przechwycone w kanale, popchnij górną część kanału pęsetą, aby zdestabilizować i wyeliminować pęcherzyki powietrza. Gdy urządzenie jest całkowicie napełnione roztworem buforowym, wymień probówkę PBS, aby przygotować probówkę z próbką wydzieliny z dróg oddechowych.
- Po umieszczeniu próbki w zbiorniku na próbkę włącz pompę perystaltyczną i ustaw natężenie przepływu na 4 ml/min (rysunek 1C, D).
- Gdy objętość próbki osiągnie wyznaczoną objętość (~1 ml), przerwij operację i odłącz silikonową rurkę.
nuta: Proponowana metoda jest bardziej skuteczna w zmniejszaniu dużej objętości rozcieńczalnika (>50 ml) do objętości probówki mikrowirówki (~1 ml) (rysunek 2).
