Znakowanie mysich limfocytów T Helper za pomocą znakowanych radioaktywnie przeciwciał monoklonalnych

Streszczenie

Źródło: Hoffmann, S. H. L., et al., Mysie limfocyty znakowane przez ⁶⁴Cu-przeciwciała ukierunkowane na receptor in vivo do transportu komórek in vivo przez PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie demonstrujemy wewnątrzkomórkowe znakowanie radiokomórkowe komórek pomocniczych T za pomocą radioaktywnych przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z izotopami do nieinwazyjnego obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej.

Protokół

>1. Znakowanie radiokomórkowe cOVA-TH1

UWAGA: ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb zostaną zastosowane do hodowanych komórek cOVA-TH1, aby umożliwić wewnątrzkomórkowe znakowanie radioaktywne.

1. W celu znakowania radioizotopowego komórek cOVA-TH1 należy pobrać 37 MBq z ^{znakowanych radioizotopowo 64}Cu-DOTA-KJ1-26-mAb do strzykawki bez martwej objętości za pomocą kalibratora dawki. Dodaj 1 ml soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór o stężeniu 37 MBq/ml.
2. Zawieś komórki cOVA-TH1 w pożywce w ilości 2 x 10⁶ komórek/ml i dodaj 0,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki na 48-dołkowej płytce.
3. Dodać 20 μl świeżo przygotowanego roztworu 37 MBq/ml ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Ostateczny stosunek do etykietowania wynosi 0,7 MBq na 10-6 komórek w objętości 520 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C i 7,5% CO₂ przez 30 minut.
4. Po inkubacji ostrożnie ponownie zawiesić komórki w każdym dołku i przenieść zawiesinę komórek z płytki 48-dołkowej do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml. Aby zminimalizować utratę komórek, spłucz każdą studzienkę wstępnie podgrzanym podłożem.
5. Odwirować zawiesinę komórek cOVA-TH1 o sile 400 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego PBS. Usunąć podwielokrotność zawiesiny komórek w celu zliczenia komórek. Powtórz krok prania.
6. Policzyć żywotne komórki cOVA-TH1 w odpowiednim rozcieńczeniu z barwieniem błękitem trypanowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Moduł roboczy 64Cu	WKL	Wykonane na zamówienie	Produkcja 64Cu
Kalibrator dawki	Firma Capintec	CRC-25R
Cyklotron PETtrace	Systemy medyczne General Electric
DOTA-NHS (Służba Zdrowia Narodowa)	Makrocykliczne	B-280
Przeciwciało anty-cOVA-TCR (KJ1-26)		Wyizolowany z hodowli komórkowej hybrydoma	Koniugacja DOTA
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 71633	Koniugacja DOTA
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C7901	Koniugacja DOTA
Jednostka filtrująca Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910008	Koniugacja DOTA
Ultraczysta woda Rotipuran	Carla Rotha	Zobacz materiał HN68.3	Koniugacja DOTA
Octan amonu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 32301	Koniugacja DOTA
Pbs	Uniwersytet w Tybindze		Koniugacja DOTA
Kolumna Micro Bio-spin P-6	Laboratoria Bio-Rad	7326221	Koniugacja DOTA
Cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 71497	Koniugacja DOTA
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	Koniugacja DOTA
DMEM (DMEM)	Merck Millipore	102568	Składnik pożywki dla limfocytów T
Fcs	Merck Millipore	S0115/1004B	Składnik pożywki dla limfocytów T
Pirogronian sodu	Merck Millipore	L0473	Składnik pożywki dla limfocytów T
Aminokwasy MEM	Merck Millipore	Zobacz materiał K0293	Składnik pożywki dla limfocytów T
HEPESY	Merck Millipore	L 1613	Składnik pożywki dla limfocytów T
Penicylina/Streptomycyna	Merck Millipore	Certyfikat A2212	Składnik pożywki dla limfocytów T
0,05 mM 2-β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M3148	Składnik pożywki dla limfocytów T
Myszy DO11.10		Hodowla własna	Hodowla komórkowa TH1
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Gibco (firma Gibco)	14190144	Hodowla komórkowa TH1
Sitko do komórek 40 μm	Corning	Numer telefonu 352340	Hodowla komórkowa TH1
Bufor Lizy ACK	Lonza	10-548E	Hodowla komórkowa TH1
CD4 MicroBeads, mysz	Technologia biologiczna Miltenyi	Numer katalogowy: 130-097-145	Hodowla komórkowa TH1
Separator QuadroMACS	Technologia biologiczna Miltenyi	Numer katalogowy: 130-090-976	Hodowla komórkowa TH1
Kolumna LS	Technologia biologiczna Miltenyi	Numer katalogowy: 130-042-401	Hodowla komórkowa TH1
Przeciwciało anty-CD4 (Gk1,5)		Wyizolowany z hodowli komórkowej hybrydoma	Hodowla komórkowa TH1
Przeciwciało anty-CD8 (5367.2)		Wyizolowany z hodowli komórkowej hybrydoma	Hodowla komórkowa TH1
Przeciwciało przeciw szczurom (MAR18.5)		Wyizolowany z hodowli komórkowej hybrydoma	Hodowla komórkowa TH1
Dopełnienie królika MA	tebu-Bio	Zobacz materiał CL3221	Hodowla komórkowa TH1
Przeciwciało anty-IL-4 (11B11)		Wyizolowany z hodowli komórkowej hybrydoma	Hodowla komórkowa TH1
peptyd cOVA 323-339	Mikrokolekcje EMC	Na zamówienie	Hodowla komórkowa TH1
CPG1668-oligonukleotydy	Eurofins MWG Operon	Na zamówienie	Hodowla komórkowa TH1
IŁ-2	Novartis	Nr kat. 65483-116-07	Hodowla komórkowa TH1
Płytki 96-dołkowe	Greiner	Numer katalogowy: 655180	Hodowla komórkowa TH1
Płytki 24-dołkowe	Greiner	Numer katalogowy: 662160	Hodowla komórkowa TH1
Kolba do hodowli komórkowych	Greiner	660175	Hodowla komórkowa TH1
Płytki 48-dołkowe	Greiner	677 180	Etykietowanie komórek
Gammacell 1000	Najlepsza teratronika	Poprzez zapytanie ofertowe
Gulmay RT225	Gulmay (Gulmay)	Poprzez zapytanie ofertowe
Trypan niebieski	Merck Millipore	L6323	Ocena in vitro

Klienta TGL