$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie odczynnika i materiału
- Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
nuta: Utrzymuj bufor na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby uzyskać optymalne wyniki.
- Przygotuj 50 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej RPMI 1640, 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Do różnicowania komórek THGM Użyj kompletnych pożywek RPMI zawierających 50 μM β-merkaptoetanolu. Dodaj β-merkaptoetanol do dygestorium.
- Przygotować 7,5 ml mieszaniny przeciwciał anty-CD3e, rozcieńczając skoncentrowany zapas anty-CD3e do 3 μg/ml w PBS. Pokryć płytki 48-dołkowe, dodając 150 μl mieszaniny przeciwciał do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
- Wysterylizuj nożyczki i kleszcze i przechowuj je w 70% etanolu między sekcjami.
2. Przygotowanie mysich splenocytów
- Poddaj mysz eutanazji (6-8 tygodni) za pomocą instytucjonalnie zatwierdzonego uduszenia CO2 lub zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj mysz 70% etanolem i zamontuj ją na bloku styropianowym z tyłu. Przenieś mysz do szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać następujące kroki.
- Przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę poniżej klatki piersiowej po lewej stronie na około 4 cm, używając nożyczek. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć śledzionę.
- Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż je 2 ml buforu. Umieść śledziony na sitku do komórek (2-3 śledziony na jedno sitko do komórek) i zmaceruj je za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
- Przepłucz sitko i probówkę kilka razy 1–2 ml buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną wypłukane do probówki. Odrzucić sitko do komórek i odwirowywać komórki przy sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 5 ml zimnego (4 °C) buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2–7,4) i delikatnie mieszać przez 2 min. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor ACK i natychmiast odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
3. Izolacja limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznych mikrokulek CD4 i kolumny do separacji komórek
- Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do izolacji komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą filtra wstępnej separacji (30 μm) do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
- Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć 10x, dodając 90 μl buforu. Pobrać 10 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek i wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Policz komórki w hemocytometrze, aby określić wydajność żywotnych komórek.
- Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w 90 μl buforu na 10-7 komórek. Dodaj 10 μl magnetycznych mikrokulek CD4 na 107 komórek. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać optymalne wyniki, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową co 5 minut podczas inkubacji.
- Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym. Wstępnie zwilżyć kolumnę 2 ml buforu.
- Pod koniec inkubacji komórki/kulki przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu, załadować próbkę do kolumny separacji komórek i pozwolić jej przepłynąć. Użyj probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zebrać frakcję komórek CD4. Dodać 1 ml buforu, aby umyć zbiornik przed wyschnięciem. Powtórz krok prania 2x.
- Wyjmij kolumnę do separacji komórek ze stojaka magnetycznego i umieść ją na nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml buforu do izolacji komórek do kolumny do separacji komórek i mocno przyłożyć tłok, aby wypchnąć komórki z kolumny.
- Odwirować frakcję o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania komórek CD4+. Odrzucić supernatant.
4. Oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD4+ (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i różnicowanie THGM
- Otrzymany osad komórek CD4+ zawiesić ponownie w 500 μl buforu. Wymieszaj komórki z mieszaniną przeciwciał sprzężonych z fluorescencją zawierającą CD4-PerCp (2,8 μg/ml), CD44-APC (2,4 μg/ml), CD25-PE (2 μg/ml) i CD62L-FITC (10 μg/ml) (Tabela 1). Inkubuj komórki na lodzie przez 20–30 minut, chroniąc je przed światłem.
nuta: Stężenia przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium. Podana liczba przeciwciał dotyczy komórek od 1 do 2 myszy.
- Po inkubacji przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu. Ponownie przefiltruj komórki za pomocą nylonowej siatki.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS w celu sortowania komórek. Wstępnie pokryj probówki z kolekcją FACS 500 μl buforu.
- Uzyskaj populacjęhi CD4 + CD25-CD44loCD62L (naiwnych limfocytów T CD4 +) przez sortowanie FACS. Najpierw należy wziąć bramkę na CD4 + CD25-, a następnie wybrać komórkihi CD44loCD62L z tej populacji.
- Zbierz naiwne frakcje limfocytów T CD4 + do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
- Zawiesić naiwne limfocyty T CD4 + w stężeniu 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI zawierającej 50 μM β-merkaptoetanolu.
- Odessać przeciwciała anty-CD3e używane do wstępnego powlekania w płytce 48-dołkowej. Zasiaj 0,25 miliona (250 μl) komórek w każdym dołku z IL-7 (2 ng / ml), anty-CD28 (1 μg / ml) i anty-IFNγ (10 μg / ml) (tabela 1).
nuta: Stężenia cytokin i przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium pod kątem różnicowania komórekT HGM.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni. Nie zmieniaj pożywki podczas inkubacji.
5. Analiza mysich komórek genetycznych Gwygenerowanych in vitro
- Za pomocą mikroskopu sprawdź różnicowanie komórek 3 dni po różnicowaniu. Zebrać komórki i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 2x za pomocą kompletnej pożywki RPMI.
nuta: Zróżnicowane komórki są większe niż naiwne limfocyty T CD4 +.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj ją z 10 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Podziel zróżnicowane komórki na trzy mikstury w celu ponownej stymulacji i analizy.
nuta: Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych wymaga ≥0,5 miliona komórek.
- W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych należy ponownie stymulować komórki 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) (100 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) w obecności inhibitora transportu białek (1 μl/ml) przez 4–6 godzin.
- Zbierz komórki i wybarwić je przeciwciałem anty-CD4 (sprzężonym z PerCP, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; lub sprzężonym z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut.
- Utrwalić komórki za pomocą 200 μl buforu utrwalającego przez 20–60 minut. Po utrwaleniu przemyć komórki 2x 1 ml buforu do permeabilizacji.
- Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe przeciwciałami przeciwko GM-CSF (sprzężony z PE, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-17A (sprzężony z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; APC-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-4 (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) i IFNγ (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; PE-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut w ciemności.
Tabela 1: Użyte cytokiny i przeciwciała.
| nazwa | Koncentracja zapasów | Koncentracja robocza | Rozcieńczeniu | Objętość w 500 μL buforze barwiącym |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/ml | 2,8 μg/ml | Godzina 1:71 | 7 μL |
| CD44-APC (Przekaźnik Zabezpieczenia) | 0,2 mg/ml | 2,4 μg/ml | Godzina 1:83 | 6 μL |
| CD25-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | 5 μL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/ml | 10 μg/ml | 1:50 | 10 μL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IŁ-17A-FITC | 0,5 mg/ml | 5 μg/ml | 1:100 | |
| Transporter opancerzony IŁ-17A | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IFNγ-APC | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| IFNγ-PE | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| Ił-4-transporter opancerzony | 0,2 mg/ml | 2 μg/ml | 1:100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/ml | 5 μg/ml | 1:100 | |
| IŁ-7 | 20 μg/ml | 2 ng/ml | 1:10000 | |
| Anty-CD28 | 0,5 mg/ml | 1 μg/ml | 1:500 | |
| Anty-IFNγ | 1 mg/ml | 10 μg/ml | 1:100 | |