Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Dysocjacja mózgu i magnetyczna izolacja mikrogleju
UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkami i ponowne zawieszanie muszą być wykonywane za pomocą pipety o pojemności 1 000 μL z dużą ostrożnością. Zastosowanie silnego działania mechanicznego może aktywować lub zabić komórki mikrogleju.
- Przenieś 12 kawałków mózgu (~1,2 g) na probówkę dysocjacyjną zawierającą mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tabelą 1. Dla 24 szczeniąt potrzebne będą cztery rurki C (rysunek 1A-B).
- Umieść rurki C na dysocjatorze (z trybem grzania). Uruchom zoptymalizowany program NTDK w sprzęcie zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 1D).
- Wirować przy 300 x g przez 20 s (w temperaturze 4 °C) w celu zebrania wszystkich komórek. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (rysunek 1E).
- Przenieś komórki do czterech probówek o pojemności 15 ml + sitka. Przepłucz sitka 10 ml 1x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) z Ca2+ i Mg2+ (HBSS+/+) (Rysunek 1F).
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml HBSS+/+ (Rysunek 1G).
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 6 ml buforu sortującego (1x PBS + 0,5% BSA) (Rysunek 1H).
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Dodać 200 μl roztworu mikrogranulek CD11b do probówki i ostrożnie zawiesić (Rysunek 1I).
- Inkubować probówki przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zawiesić osad z 6 ml buforu sortującego (Rysunek 1I-J).
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 8 ml buforu sortującego (Rysunek 1K).
- Postępuj zgodnie z programem POSSEL na separatorze (patrz Tabela materiałów), aby przygotować osiem kolumn. Przenieść komórki 1 ml na 1 ml na kolumnę. Poczekaj, aż wszystkie komórki przejdą przed dodaniem kolejnego ml. Eluować komórki CD11b+ na sterylnej płytce elucyjnej z 1 ml buforu sortującego (ryc. 1L).
- Umieść komórki CD11b+ w nowej probówce o pojemności 50 ml (ryc. 1M).
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml zimnej pożywki dla mikrogleju (pożywka hodowlana bez surowicy makrofagów (SFM) + 1% penicyliny-streptomycyny (P/S)) (Figura 1N).
- Policz komórki CD11b+. W P8 należy uzyskać ~650 000 komórek na mózg.
nuta: W niniejszym protokole komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
- Zawiesić komórki w zimnej pożywce mikrogleju do końcowego stężenia 650 000-700 000 komórek/ml i dozować na płytkach do hodowli komórkowych.
nuta: Płytki 6-dołkowe są przeznaczone do Western Blot (2 ml na dołek); płytki 12-dołkowe służą do analizy RT-qPCR (1 ml na studzienkę), a płytki 96-dołkowe służą do oznaczania fagocytarnego (250 μl na dołek).
Tabela 1: Przygotowanie mieszaniny dysocjacyjnej.
szt.
TGL
Rozdział
szt.
Rozdział
szt.
TGL
| rozwiązanie | Na jedną rurkę C (μL) | Na cztery rurki C (μL) |
| Bufor X | 2850 | Numer katalogowy 11400 |
| Enzym P (papaina) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Bufor Y | Rozdział 30 | 120 |
| łączny | Numer katalogowy 2970 | Numer katalogowy: 11880 |
