Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Dysocjacja mózgu i magnetyczna izolacja mikrogleju

UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkami i ponowne zawieszanie muszą być wykonywane za pomocą pipety o pojemności 1 000 μL z dużą ostrożnością. Zastosowanie silnego działania mechanicznego może aktywować lub zabić komórki mikrogleju.

1. Przenieś 12 kawałków mózgu (~1,2 g) na probówkę dysocjacyjną zawierającą mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tabelą 1. Dla 24 szczeniąt potrzebne będą cztery rurki C (rysunek 1A-B).
2. Umieść rurki C na dysocjatorze (z trybem grzania). Uruchom zoptymalizowany program NTDK w sprzęcie zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 1D).
3. Wirować przy 300 x g przez 20 s (w temperaturze 4 °C) w celu zebrania wszystkich komórek. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (rysunek 1E).
4. Przenieś komórki do czterech probówek o pojemności 15 ml + sitka. Przepłucz sitka 10 ml 1x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) z Ca²⁺ i Mg²⁺ (HBSS+/+) (Rysunek 1F).
5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml HBSS+/+ (Rysunek 1G).
6. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 6 ml buforu sortującego (1x PBS + 0,5% BSA) (Rysunek 1H).
7. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Dodać 200 μl roztworu mikrogranulek CD11b do probówki i ostrożnie zawiesić (Rysunek 1I).
8. Inkubować probówki przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zawiesić osad z 6 ml buforu sortującego (Rysunek 1I-J).
9. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 8 ml buforu sortującego (Rysunek 1K).
10. Postępuj zgodnie z programem POSSEL na separatorze (patrz Tabela materiałów), aby przygotować osiem kolumn. Przenieść komórki 1 ml na 1 ml na kolumnę. Poczekaj, aż wszystkie komórki przejdą przed dodaniem kolejnego ml. Eluować komórki CD11b+ na sterylnej płytce elucyjnej z 1 ml buforu sortującego (ryc. 1L).
11. Umieść komórki CD11b+ w nowej probówce o pojemności 50 ml (ryc. 1M).
12. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml zimnej pożywki dla mikrogleju (pożywka hodowlana bez surowicy makrofagów (SFM) + 1% penicyliny-streptomycyny (P/S)) (Figura 1N).
13. Policz komórki CD11b+. W P8 należy uzyskać ~650 000 komórek na mózg.
    nuta: W niniejszym protokole komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
14. Zawiesić komórki w zimnej pożywce mikrogleju do końcowego stężenia 650 000-700 000 komórek/ml i dozować na płytkach do hodowli komórkowych.
    nuta: Płytki 6-dołkowe są przeznaczone do Western Blot (2 ml na dołek); płytki 12-dołkowe służą do analizy RT-qPCR (1 ml na studzienkę), a płytki 96-dołkowe służą do oznaczania fagocytarnego (250 μl na dołek).

Tabela 1: Przygotowanie mieszaniny dysocjacyjnej.

Rycina 1: Schematyczne przedstawienie dysocjacji mózgu i izolacji komórek mikrogleju. (A-C) Po rozbiorze mózgu myszy P8 i usunięciu opuszki węchowej i móżdżku, mózgi najpierw przeniesiono na szalkę Petriego z HBSS+/+, a następnie do probówek dysocjacyjnych zawierających mieszaninę dysocjacyjną. C-rurki umieszczono na dysocjatorze (z trybem grzania) i uruchomiono program NTDK (D). (E) Pod koniec programu probówki odwirowywano przy ciśnieniu 300 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C; dysocjację zakończono następnie trzykrotnym pipetowaniem w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. (F) Komórki następnie przeniesiono do probówek o pojemności 15 ml + sitek o wielkości 70 μm i przepłukano 10 ml HBSS+/+. (G) Próbki następnie odwirowywano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, supernatant usunięto, a osad ponownie zawieszono w 10 ml HBSS+/+. (H) Probówki ponownie odwirowywano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; supernatant usunięto, a następnie osad zawieszono ponownie w 6 ml buforu sortującego. (I) Probówki odwirowywano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, usunięto supernatant i dodano roztwór mikrogranulek CD11b (200 μl). Probówki inkubowano przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zawieszono w 6 ml buforu sortującego (J) i odwirowywano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. (K) Supernatant usunięto, a osad ostrożnie zawieszono ponownie w 8 ml buforu sortującego. (L) Następnie uruchom program POSSEL na separatorze, aby przygotować kolumny. Komórki przeniesiono 1 ml na 1 ml na kolumnę, a komórki CD11b eluowano na sterylnej płytce elucyjnej z 1 ml buforu sortującego. (M) Komórki CD11b zebrano w nowej probówce o pojemności 50 ml i odwirowano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunięto supernatant. (N) W ostatnim etapie osad ostrożnie zawieszono w 10 ml zimnej pożywki dla mikrogleju. Komórki policzono i rozcieńczono w pożywce mikrogleju do końcowego stężenia 650 000-700 000 komórek/ml dozowanych na płytkach do hodowli komórkowych.