Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Streszczenie

Mikroskopia sił atomowych (AFM) umożliwia wizualizację pojedynczych białek, cząsteczek DNA, kompleksów białko-białko oraz kompleksów DNA-białko. Na końcu wspornika mikroskopu znajduje się sonda w skali nano, która przemieszcza się po obszarach obrazowania o rozmiarach od nanometrów do mikrometrów, mierząc wysokość makrocząsteczek spoczywających na powierzchni podłoża w dowolnym punkcie. Siły elektrostatyczne powodują, że białka, lipidy i kwasy nukleinowe luźno przyczepiają się do podłoża w losowych orientacjach, co umożliwia obrazowanie. Wygenerowane dane przypominają mapę topograficzną, na której makrocząsteczki są widoczne jako trójwymiarowe cząstki o określonych rozmiarach (Rysunek 1) ^1,2. AFM w trybie stukowym (tapping mode) polega na powtarzających się oscylacjach wspornika, co pozwala na obrazowanie stosunkowo miękkich biomateriałów, takich jak DNA i białka. Jedną z istotnych zalet AFM w porównaniu z innymi technikami mikroskopii w nanoskali jest jego relatywna zdolność do wizualizacji pojedynczych białek i kompleksów makrocząsteczkowych w buforach wodnych, w tym w warunkach buforowych zbliżonych do fizjologicznych, w czasie rzeczywistym oraz bez konieczności barwienia lub powlekania obrazowanej próbki.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy opisuje obrazowanie DNA oraz immunoadsorbowanego czynnika transkrypcyjnego (tj. receptora glikokortykoidowego, GR) w roztworze buforowanym (Rycina 2). Immunoadsorbowane białka i kompleksy białkowe można oddzielić od osadu kulek z przeciwciałami immunoadsorbującymi poprzez konkurencję z epitopem przeciwciała, a następnie poddać obrazowaniu (Rycina 2A). Pozwala to na manipulację biochemiczną badanymi biomolekułami przed etapem obrazowania. Po oczyszczeniu DNA i białka można zmieszać, a następnie obrazować powstały kompleks oddziałujący. Wiązanie DNA do miki wymaga kationu dwuwartościowego ³, takiego jak Ni²⁺ lub Mg²⁺, który może zostać dodany do buforów próbkowych przy jednoczesnym zachowaniu aktywności białek. Stosując podobne podejście, AFM wykorzystywano do wizualizacji pojedynczych enzymów, w tym polimerazy RNA ⁴ oraz enzymu naprawczego ⁵, związanych z pojedynczymi niciami DNA. Eksperymenty te dostarczają istotnych informacji na temat biofizycznych oddziaływań białko-białko i DNA-białko zachodzących na poziomie molekularnym. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek makromolekularnych za pomocą AFM może być przydatne do określenia homogeniczności cząstek oraz identyfikacji fizycznego rozmieszczenia komponentów składowych obrazowanych cząstek. Chociaż obecna metoda została opracowana do wizualizacji kompleksów białkowych GR-białka opiekuńcze ^1,2 oraz nici DNA, z którymi GR może się wiązać, może ona znaleźć szerokie zastosowanie w obrazowaniu próbek DNA i białek z różnych źródeł.

Protokół

1. Przygotowanie próbek DNA i białek do obrazowania w sposób wolny od zanieczyszczeń

1. Wyizolować biomolekuły przeznaczone do obrazowania i umieścić je w odpowiednim buforze wodnym. Białka do obrazowania można oczyszczać za pomocą chromatografii cieczowej ⁶, immunoadsorpcji z późniejszym usunięciem przeciwciała i otrzymaniem osadu ^1,2 lub oczyszczania przy użyciu systemu Profinity eXact z usunięciem znacznika ⁷ (Rysunek 2A). Cząsteczki DNA do obrazowania wyizolować za pomocą oczyszczania metodą miniprep (Rysunek 2B).
2. Potwierdzić skład i czystość próbek białek do obrazowania za pomocą SDS-PAGE i western blottingu. W przypadku DNA potwierdzić sekwencję i czystość, przeprowadzając trawienie restrykcyjne oraz elektroforezę w żelu agarozowym.
3. Inkubować próbki w buforze adsorpcyjnym do AFM, aby wspomóc przyleganie próbki do miki. Dla próbek białek można zastosować bufor HEPES 10 mM. Można również dodać dodatkowe sole o niskiej sile jonowej lub inne kofaktory. W przypadku próbek DNA należy dodać kation dwuwartościowy (np. Mg²⁺ lub Ni²⁺), aby wspomóc adsorpcję do podłoża mikowego. Odpowiednim buforem zawierającym Mg²⁺ dla DNA jest 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ ³. Alternatywnym buforem zawierającym Ni²⁺ jest 10 mM HEPES, pH 6.8, 10 mM NiCl₂.
4. Rozcieńczyć próbkę do stężenia 5 μg/ml w buforze adsorpcyjnym. Delikatnie wymieszać. Przechowywać w lodzie podczas przygotowywania mikroskopu.

2. Montaż sondy AFM

1. Umieść uchwyt sondy do komórki cieczowej na odpowiadającej mu stacji dokującej do instalacji wsporników.
2. Zlokalizuj długi, gruby wspornik (oznaczony jako wspornik „B”) sondy z ostrym azotkiem (SNL), która będzie użyta do obrazowania. Ostrożnie przenieś go do uchwytu sondy do komórki cieczowej, dbając o to, aby końcówka pozostała w pozycji pionowej. Uwaga techniczna: Należy zachować szczególną ostrożność podczas przenoszenia sondy, ponieważ upuszczenie jej z jakiejkolwiek wysokości może uszkodzić lub zniszczyć wspornik lub końcówkę. Jako alternatywa dla sondy SNL można zastosować sondę z mikro-wspornikiem SNL (MSNL).
3. Wyjmij uchwyt sondy ze stacji dokującej i obejrzyj wspornik pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że jest nieuszkodzony i prawidłowo osadzony w uchwycie sondy do komórki cieczowej.
4. Ostrożnie zdejmij głowicę AFM z prowadnicy instrumentu, poluzowując radełkowaną śrubę zaciskową głowicy. Uwaga techniczna: Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania głowicą AFM, ponieważ upuszczenie jej nawet z niewielkiej wysokości (np. w przypadku nieprawidłowego osadzenia w prowadnicy) może spowodować znaczne uszkodzenia.
5. Odwróć głowicę AFM i mocno wciśnij uchwyt sondy do komórki cieczowej na cztery piny znajdujące się u podstawy głowicy AFM. Ostrożnie zamontuj głowicę AFM z powrotem w prowadnicy instrumentu. Dokręć radełkowaną śrubę zaciskową, aby przymocować głowicę AFM do instrumentu.

3. Lokalizacja końcówki wspornika, ustawianie lasera i regulacja fotodetektora

1. Za pomocą oprogramowania urządzenia AFM zlokalizuj końcówkę wspornika (cantilever), poruszając pokrętłami wbudowanego mikroskopu świetlnego. W razie potrzeby dostosuj oświetlenie mikroskopu, aby ułatwić identyfikację końcówki. Przesuń koniec końcówki wspornika w bezpośrednie sąsiedztwo krzyżyka wyświetlanego w oprogramowaniu urządzenia.
2. Ustaw ostrość końcówki wspornika, korzystając ze strzałek góra i dół kontrolera optyki w oprogramowaniu. Podczas regulacji optyki stosuj prędkość niską (S) lub średnią (M).
3. Wyrównaj laser względem końcówki wspornika, używając pokręteł regulacji lasera. Obracaj pokrętła regulacyjne, aż czerwona kropka lasera znajdzie się wewnątrz białej plamy oświetlenia. Przesuwaj się wzdłuż ramienia wspornika zygzakowatym wzorem, aż laser zostanie ustawiony na końcówce wspornika. Po prawidłowym wyrównaniu w przednim oknie głowicy AFM pojawi się silna plama refleksu.
4. Wycentruj fotodetektor, regulując pokrętła fotodetektora na głowicy AFM. Spowoduje to ustawienie kropki lasera w krzyżyku wyświetlacza fotodetektora w oprogramowaniu urządzenia. Obserwowana suma sygnałów powinna wynosić około 4-6.

4. Pozycjonowanie głowicy AFM i strojenie wspornika

1. Umieść świeżo rozłupaną płytkę miki przymocowaną do metalowego dysku na próbki AFM na zmagnesowanym uchwycie próbek znajdującym się na płycie podstawy AFM. Konfiguracja ta posłuży do ustawienia głowicy AFM przed obrazowaniem próbki DNA lub białka przygotowanej w kroku 1.
   1. Uwaga techniczna: Zmagnesowany uchwyt próbek oraz uchwyt sondy do komórki z cieczą są grubsze niż inne mechanizmy mocowania próbek i uchwyty sond. Jeśli obecnie odstęp między zestawem płytka miki-uchwyt próbek a głowicą AFM jest niewystarczający, przesuń głowicę AFM w górę, klikając kilkukrotnie ikonę wycofania (withdraw) w oprogramowaniu instrumentu.
2. Obróć płytę podstawy AFM tak, aby dysk z próbką był ustawiony do wstępnego obrazowania. Upewnij się, że podłoże z miki znajduje się w centrum pod głowicą AFM.
3. Przesuń głowicę AFM w dół w stronę powierzchni dysku z miką, korzystając z funkcji sterowania ogniskowaniem powierzchni (focus surface) w oprogramowaniu instrumentu. Wybierz średnią (M) prędkość silnika osi Z i kontynuuj ruch w stronę powierzchni, aż głowica AFM znajdzie się około 2 mm nad miką. W tym momencie przełącz się na wolną (S) prędkość silnika osi Z, aby uniknąć gwałtownego kontaktu sondy z powierzchnią (zwanego uderzeniem końcówki, ang. crashing the tip).
4. Przesuwaj sondę bliżej powierzchni podłoża z miki, aż wyraźne cechy powierzchni miki lub odbicie końcówki zostaną ustawione w ostrości. Przełączaj się między płaszczyznami ogniskowania powierzchni i odbicia końcówki, korzystając z ikony „focus on:” w oprogramowaniu instrumentu.
5. Wybierz ikonę strojenia (tune) w oprogramowaniu instrumentu i przeprowadź strojenie wspornika. Częstotliwość rezonansowa zalecanych sond z wspornikami SNL i MSNL wynosi 20-60 kHz. Wybierz 5% przesunięcia szczytu (peak offset). Uwaga techniczna: Prawidłowe strojenie wspornika jest niezbędne do uzyskania odpowiedniego obrazowania próbki.

5. Obrazowanie powierzchni próbki mikowej

1. Przystaw sondę do powierzchni miki. Ustaw początkowy rozmiar skanowania na 10 μm, a szybkość skanowania na 1 Hz. Wzmocnienie całkowe i proporcjonalne można początkowo ustawić odpowiednio na 0,2 i 0,4. Dostosuj wzmocnienia w taki sposób, aby skany w przód i w tył (trace i retrace) mniej więcej się pokrywały. Zmniejszenie wartości zadanej amplitudy zwiększy oddziaływanie między sondą a miką i zapewni kontakt.
2. Wykonaj pełne obrazy skanowania pola o rozmiarze 10 μm. Zmniejsz rozmiar skanowania do 5, 1 i 0,5 μm i wykonaj pełne obrazy każdego z tych pól. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienia oraz szybkość skanowania. Pozyskanie obrazów powierzchni miki stanowi punkt odniesienia do porównania z próbkami zawierającymi DNA i białka.
3. Odsuń sondę, klikając raz ikonę odłączenia (disengage) w oprogramowaniu urządzenia.

6. Obrazowanie wybranych biomolekuł

1. Delikatnie wymieszaj próbkę DNA lub białka przygotowaną w kroku 1 i przygotuj ją do naniesienia na obrazowaną powierzchnię miki. Wymieszaj 5 μl przygotowanej próbki z 45 μl świeżego buforu adsorpcyjnego (końcowe stężenie próbki = 0,5 μg/ml).
2. Ostrożnie nanieś 50 μl roztworu zawierającego biomolekuły o stężeniu 0,5 μg/ml bezpośrednio na powierzchnię miki. Wykonaj to bez przesuwania sondy lub głowicy AFM, upewniając się, że roztwór próbki (ale nie końcówka pipety) styka się z sondą.
3. Odczekaj 5 minut, aby biomolekuły w próbce mogły przywrzeć do powierzchni miki.
4. Po upływie 5 minut pipetuj dodatkowe 50-100 μl buforu adsorpcyjnego do uchwytu sondy celi cieczowej, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła sondy, głowicy AFM ani miki. Utworzy to menisk i umożliwi obrazowanie w trybie tapping AFM w cieczy. Rycina 3 przedstawia końcowy układ celi cieczowej, wspornika, próbki, uchwytu próbki oraz menisku.
5. Ponownie ustaw fotodetektor i wyrównaj laser względem wspornika w razie potrzeby. Uwaga techniczna: obserwacja końcówki sondy i wyrównanie lasera są utrudnione ze względu na wzór dyfrakcyjny powstały w wyniku dodania buforu próbki do uchwytu sondy. W razie potrzeby ręcznie dostrój wspornik.
6. Ponownie zbliż sondę do powierzchni za pomocą oprogramowania instrumentu. Dostosuj ugięcie pionowe, wzmocnienie całkowe i wzmocnienie proporcjonalne w razie potrzeby. Rozpocznie to proces ponownego obrazowania sekcji miki skanowanej bezpośrednio przed dodaniem próbki i przechwytywanie obrazów.
7. Zwiększ rozmiar skanu (500 nm-10 μm), aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Powiększ obraz i zmniejsz prędkość skanowania do 0,5 Hz, aby poprawić rozdzielczość obrazu.
8. Po zakończeniu obrazowania wycofaj sondę, kilkakrotnie wybierając ikonę wycofania w oprogramowaniu instrumentu. Przed demontażem celi cieczowej lub dysku z próbką upewnij się, że zachowano wystarczający odstęp między głowicą AFM a dyskiem z próbką.
9. Dokładnie wypłucz uchwyt sondy celi cieczowej oraz dysk z próbką wodą destylowaną, aby zapobiec tworzeniu się kryształków soli podczas odparowywania pozostałości buforu adsorpcyjnego. Wysusz sprężonym powietrzem.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady obrazów AFM przedstawiono na Rysunku 4. Podłoże z miki (A) zapewnia powierzchniowo płaską strukturę molekularną, na której mogą adsorbować się DNA i białka. Obrazowanie miki przed próbkami biomolekuł służy jako kontrola negatywna i pozwala na ocenę szumu obrazowania. Zapewnia to również pewność, że wspornik jest odpowiednio nastrojony, a kolejne obrazowanie próbek przebiegnie pomyślnie. Dwuniciowe plazmidowe DNA (B, D), prawdopodobnie superzwinięte, jest łatwo rozpoznawalne po asymetrycznym wyglądzie i jednolitym osadzaniu się na wcześniej niecharakterystycznym podłożu z miki. Kompleksy białkowe o określonych rozmiarach cząstek (C, E) są również wyraźnie odróżnialne od podłoża z miki. Różnice w wielkości cząstek wskazują na heterogenność próbki i mogą być przydatne do przybliżonego określenia stechiometrii kompleksów białkowych lub aktywności biochemicznej. Ogólny przekątny kształt i spójna orientacja cząstek białkowych zaobserwowanych w panelu C są artefaktem obrazowania, ponieważ białka powinny być zorientowane na podłożu z miki w sposób losowy. Możliwymi przyczynami zaobserwowanego artefaktu są fizyczne uszkodzenie wierzchołka sondy lub obrazowanie AFM przy zbyt szybkim tempie skanowania. Chociaż splot wierzchołka (przedstawiony na Rysunku 1B) uniemożliwia obliczenie absolutnych pomiarów długości w osiach x i y, pomiary wysokości (oś z) oraz względne pomiary x i y mogą być niemniej jednak przydatne do szacowania właściwości biofizycznych obrazowanych biomolekuł.

Rysunek 1: Schematyczna prezentacja mikroskopii sił atomowych (AFM) w trybie stukowym. A, mikroskop. Na końcu dźwigni znajduje się ostra sonda, która oscyluje w górę i w dół podczas skanowania powierzchni podłoża z miki, do którego adsorbują się kompleksy biomolekularne. Gdy skaner porusza się w kierunkach x i y, wiązka lasera odbija się od tyłu dźwigni na detektor w postaci fotodiody pozycyjnie czułej, aby zmapować odległość w pionie (z), o którą przemieszcza się sonda, przechodząc nad kompleksami biomolekularnymi osadzonymi na mice. B. Zniekształcenie obrazu w kierunkach x i y spowodowane splotem sondy. Nominalny promień konwencjonalnej sondy z azotku krzemu jest większy niż cząstki poddawane obrazowaniu, a krawędź sondy styka się z próbką podczas przemieszczania się po powierzchni. Splot sondy sprawia, że obrazowane cząstki wydają się większe w kierunkach x i y, ale nie w kierunku z. Efekt ten można zminimalizować poprzez zastosowanie sond o mniejszym nominalnym promieniu końcówki.

Rysunek 2: Ilustracja przygotowania próbek białek i DNA poddanych immunoadsorpcji. A, Uwalnianie immunoadsorbowanego kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu przeciwciała monoklonalnego (mAb)-białko A-Sepharose (PAS). Inkubacja immunoosadu z peptydem zawierającym epitop mAb ułatwi uwalnianie kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu, co pozwoli na zebranie kompleksu z supernatantu i wizualizację za pomocą AFM. B, Przygotowanie DNA do obrazowania AFM wymaga zastosowania buforu adsorpcyjnego z kationem dwuwartościowym. Kation dwuwartościowy zwiększa powinowactwo DNA do podłoża z miki.

Rysunek 3: Końcowe rozmieszczenie głowicy AFM, uchwytu sondy celi cieczowej, próbki, uchwytu preparatu oraz menisku buforu. A, Należy zachować ostrożność podczas nakładania próbki i dodatkowego buforu na podłoże z miki, aby uniknąć kontaktu fizycznego między końcówką pipety a głowicą AFM, celą cieczową i podłożem z miki. B, Powiększenie fragmentu A. Menisk buforu rozciąga się od dysku z preparatem do uchwytu sondy celi cieczowej.

Rysunek 4: Mikrografie sił atomowych podłoża z miki (A), plazmidowego DNA 2xGal4-2xGRE-luciferease ⁸ (B, D) oraz kompleksów białkowych GR•hsp70 (C, E) w roztworze buforowanym. Mika służy jako obraz kontrolny do porównania z wizualizacjami DNA i białka. Kompleksy białkowe GR•hsp70 przygotowano poprzez immunoadsorpcję GR z hsp70, a następnie uwolniono z osadu przeciwciał-perełek za pomocą konkurencyjnego przeciwciała mAb (przedstawiono na Rysunku 2A). DNA przygotowano za pomocą konwencjonalnej metody miniprep plazmidów. Panele A, B i C mają takie samo powiększenie (paski skali = 200 nm), podobnie jak panele D i E (paski skali = 40 nm).

Dyskusja

AFM stanowi wyjątkową technikę mikroskopową umożliwiającą obrazowanie pojedynczych, niepowlekanych biomolekuł w czasie rzeczywistym w roztworach wodnych i buforach zbliżonych do fizjologicznych. Pozwala to na wizualizację pojedynczych białek i cząsteczek DNA, a także kompleksów wielobiałkowych oraz kompleksów białko-DNA. Obrazowanie cząsteczek makromolekularnych za pomocą AFM może być przydatne do oceny homogeniczności próbki oraz identyfikacji fizycznego rozmieszczenia komponentów tworzących obserwowane cząstki. Takie podejście, polegające na obserwacji pojedynczych cząsteczek makromolekularnych, może stanowić użyteczne uzupełnienie konwencjonalnych technik biochemicznych, takich jak testy immunoprecypitacji, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym oraz chromatografia wykluczania, które dostarczają istotnych danych sumarycznych reprezentujących 10³-10¹¹ pojedynczych, interesujących badacza kompleksów biomolekularnych obecnych w próbce.

Badania nad stechiometrią kompleksów multiproteinowych, oddziaływaniami biomolekularnymi oraz zapotrzebowaniem na kofaktory mogą być prowadzone z wykorzystaniem AFM. Przedstawiona tutaj metoda może zostać dostosowana do specyficznych pytań biofizycznych. Na przykład, stosując uchwyt sondy z komorką cieczową umożliwiającą wymianę buforu, można badać zapotrzebowanie na kofaktory niezbędne do formowania się kompleksów białkowych. Zespoły DNA-białko mogą być tworzone i dysocjowane niemal w czasie rzeczywistym, nawet w trakcie obrazowania. Można generować DNA o konkretnych, interesujących sekwencjach (np. domniemanych elementach odpowiedzi lub nowych sekwencjach wiązania białek), mieszać je z hipotetycznym białkiem wiążącym i obrazować, aby dostarczyć bezpośrednich dowodów na oddziaływania międzycząsteczkowe.

Obrazowanie AFM w trybie stukowym jest znacznie mniej skomplikowane w przypadku wykorzystania próbek suchych niż próbek w roztworach wodnych; w ten sposób obrazowano zarówno liniowe nici DNA, jak i plazmidy DNA o strukturze zamkniętego koła ^3,9. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu wykorzystuje próbki w roztworach buforowych, aby zapewnić bardziej fizjologiczne środowisko obrazowania. Należy również rozważyć inne istotne metody obrazowania białek, w tym bliskopolową mikroskopię w podczerwieni ¹⁰. Komplementarne zastosowanie immunoadsorpcji wraz z AFM daje możliwość przygotowania wielu kompleksów białkowych przy użyciu uznanych technik biochemicznych, a następnie ich wizualizacji po uwolnieniu z osadu przeciwciał związanych z kuleczkami. Na przykład, z zastosowaniem tego podejścia analizowano immunoadsorbowany GR pod kątem jego asocjacji z białkiem opiekuńczym hsp70 ¹ oraz białkiem motorowym dyneiną ², w celu oszacowania wielkości i stechiometrii kompleksów. Wielkość cząstek oraz cechy biofizyczne (np. sztywność) okazały się pomocne w ustaleniu tożsamości biomolekuł obserwowanych w próbkach obrazowanych za pomocą AFM ^11,12. Możliwe jest również potwierdzenie tożsamości biomolekuły poprzez dodanie oddziałującej biomolekuły (np. ligandu lub przeciwciała monoklonalnego), która związałaby się ze swoim celem i spowodowała zwiększenie rozmiaru cząstki, jeżeli docelowa biomolekuła jest obecna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dimension 3100	Bruker Corporation	Dimension 3100
Komora przepływowa Dimension Fluid Cell	Bruker Corporation	DTFML-DD-HE
Sonda AFM z azotku krzemu Sharp nitride lever (SNL)	Bruker Corporation	SNL-10
Sonda AFM z azotku krzemu Microlever sharp nitride lever (MSNL)	Bruker Corporation	MSNL-10
Oprogramowanie instrumentu NanoScope AFM	Bruker Corporation	004-132-000
Metalowe podkładki do próbek AFM	Ted Pella, Inc.	16208
Podkładki z miki klasy V1, 12 mm	Ted Pella, Inc.	50-12