Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Streszczenie

Mikroskopia sił atomowych (AFM) umożliwia wizualizację pojedynczych białek, cząsteczek DNA, kompleksów białko-białko oraz kompleksów DNA-białko. Na końcu wspornika mikroskopu znajduje się sonda w skali nano, która przemieszcza się po obszarach obrazowania o rozmiarach od nanometrów do mikrometrów, mierząc wysokość makrocząsteczek spoczywających na powierzchni podłoża w dowolnym punkcie. Siły elektrostatyczne powodują, że białka, lipidy i kwasy nukleinowe luźno przyczepiają się do podłoża w losowych orientacjach, co umożliwia obrazowanie. Wygenerowane dane przypominają mapę topograficzną, na której makrocząsteczki są widoczne jako trójwymiarowe cząstki o określonych rozmiarach (Rysunek 1) ^1,2. AFM w trybie stukowym (tapping mode) polega na powtarzających się oscylacjach wspornika, co pozwala na obrazowanie stosunkowo miękkich biomateriałów, takich jak DNA i białka. Jedną z istotnych zalet AFM w porównaniu z innymi technikami mikroskopii w nanoskali jest jego relatywna zdolność do wizualizacji pojedynczych białek i kompleksów makrocząsteczkowych w buforach wodnych, w tym w warunkach buforowych zbliżonych do fizjologicznych, w czasie rzeczywistym oraz bez konieczności barwienia lub powlekania obrazowanej próbki.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy opisuje obrazowanie DNA oraz immunoadsorbowanego czynnika transkrypcyjnego (tj. receptora glikokortykoidowego, GR) w roztworze buforowanym (Rycina 2). Immunoadsorbowane białka i kompleksy białkowe można oddzielić od osadu kulek z przeciwciałami immunoadsorbującymi poprzez konkurencję z epitopem przeciwciała, a następnie poddać obrazowaniu (Rycina 2A). Pozwala to na manipulację biochemiczną badanymi biomolekułami przed etapem obrazowania. Po oczyszczeniu DNA i białka można zmieszać, a następnie obrazować powstały kompleks oddziałujący. Wiązanie DNA do miki wymaga kationu dwuwartościowego ³, takiego jak Ni²⁺ lub Mg²⁺, który może zostać dodany do buforów próbkowych przy jednoczesnym zachowaniu aktywności białek. Stosując podobne podejście, AFM wykorzystywano do wizualizacji pojedynczych enzymów, w tym polimerazy RNA ⁴ oraz enzymu naprawczego ⁵, związanych z pojedynczymi niciami DNA. Eksperymenty te dostarczają istotnych informacji na temat biofizycznych oddziaływań białko-białko i DNA-białko zachodzących na poziomie molekularnym. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek makromolekularnych za pomocą AFM może być przydatne do określenia homogeniczności cząstek oraz identyfikacji fizycznego rozmieszczenia komponentów składowych obrazowanych cząstek. Chociaż obecna metoda została opracowana do wizualizacji kompleksów białkowych GR-białka opiekuńcze ^1,2 oraz nici DNA, z którymi GR może się wiązać, może ona znaleźć szerokie zastosowanie w obrazowaniu próbek DNA i białek z różnych źródeł.

Protokół

1. Przygotowanie próbek DNA i białek do obrazowania w sposób wolny od zanieczyszczeń

1. Wyizolować biomolekuły przeznaczone do obrazowania i umieścić je w odpowiednim buforze wodnym. Białka mogą być oczyszczone za pomocą chromatografii cieczowej ⁶, immunoadsorpcji z następującym po niej usunięciem przeciwciała i osadu ^1,2 lub oczyszczania metodą Profinity eXact z usunięciem znacznika ⁷ (Rysunek 2A). Cząsteczki DNA przeznaczone do obrazowania wyizolować za pomocą miniprep (Rysunek 2B).
2. Potwierdzić skład i czystość próbek białek przeznaczonych do obrazowania za pomocą SDS-PAGE i western blottingu. W przypadku DNA potwierdzić sekwencję i czystość, przeprowadzając trawienie restrykcyjne i elektroforezę w żelu agarozowym.
3. Inkubować próbki w buforze adsorpcyjnym do AFM, aby wspomóc przyleganie próbki do miki. Dla próbek białek można zastosować bufor HEPES 10 mM. Można również dodać dodatkowe sole o niskiej sile jonowej lub inne kofaktory. W przypadku próbek DNA należy dodać kation dwuwartościowy (np. Mg²⁺ lub Ni²⁺), aby wspomóc adsorpcję do podłoża mikowego. Odpowiednim buforem zawierającym Mg²⁺ dla DNA jest 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ ³. Alternatywnym buforem z Ni²⁺ jest 10 mM HEPES, pH 6.8, 10 mM NiCl₂.
4. Rozcieńczyć próbkę w buforze adsorpcyjnym do stężenia 5 μg/ml. Delikatnie wymieszać. Przechowywać w lodzie podczas przygotowywania mikroskopu.

2. Montowanie sondy AFM

1. Umieść uchwyt sondy do celi z cieczą na odpowiedniej stacji dokującej do instalacji wsporników.
2. Zlokalizuj długi, gruby wspornik (oznaczony jako wspornik „B”) sondy z ostrzem z azotku (SNL), która ma zostać użyta do obrazowania. Ostrożnie przenieś go do uchwytu sondy do celi z cieczą, upewniając się, że końcówka pozostaje w pozycji pionowej. Uwaga techniczna: Należy zachować szczególną ostrożność podczas transportu sondy, ponieważ upadek z jakiejkolwiek wysokości może uszkodzić lub zniszczyć wspornik lub końcówkę. Jako alternatywa dla sondy SNL można zastosować sondę z mikro-wspornikiem SNL (MSNL).
3. Zdejmij uchwyt sondy ze stacji dokującej i obejrzyj wspornik pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że jest nieuszkodzony i prawidłowo osadzony w uchwycie sondy do celi z cieczą.
4. Ostrożnie zdejmij głowicę AFM z prowadnicy instrumentu, dokręcając radełkowaną śrubę zaciskową głowicy. Uwaga techniczna: Podczas manipulowania głowicą AFM należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ upadek nawet z niewielkiej odległości (np. w przypadku nieprawidłowego osadzenia w prowadnicy) może spowodować znaczne uszkodzenia.
5. Odwróć głowicę AFM i mocno dociśnij uchwyt sondy do celi z cieczą do czterech pinów u podstawy głowicy AFM. Ostrożnie wprowadź głowicę AFM z powrotem do prowadnicy instrumentu. Poluzuj radełkowaną śrubę zaciskową, aby przymocować głowicę AFM do instrumentu.

3. Lokalizacja końcówki wspornika, ustawianie lasera i regulacja fotodetektora

1. Za pomocą oprogramowania urządzenia AFM zlokalizuj końcówkę wspornika, poruszając pokrętłami wbudowanego mikroskopu świetlnego. W razie potrzeby dostosuj oświetlenie mikroskopu, aby ułatwić identyfikację końcówki. Przesuń koniec końcówki wspornika w bezpośrednie sąsiedztwo przecięcia linii wyświetlanego w oprogramowaniu urządzenia.
2. Ustaw ostrość końcówki wspornika, korzystając ze strzałek góra-dół kontrolera optyki w oprogramowaniu. Podczas regulacji optyki stosuj prędkość niską (S) lub średnią (M).
3. Wyrównaj laser względem końcówki wspornika, używając pokręteł regulacji lasera. Obracaj pokrętła do momentu, aż czerwona kropka lasera znajdzie się wewnątrz białej plamy oświetlenia. Przesuwaj się wzdłuż ramienia wspornika zygzakiem, aż laser zostanie ustawiony na końcówce wspornika. Po prawidłowym wyrównaniu w przednim oknie głowicy AFM pojawi się silny punkt odbicia.
4. Wycentruj fotodetektor, regulując pokrętła fotodetektora na głowicy AFM. Spowoduje to ustawienie kropki lasera w przecięciu linii wyświetlacza fotodetektora w oprogramowaniu urządzenia. Obserwowana suma sygnału powinna wynosić około 4-6.

4. Pozycjonowanie głowicy AFM i strojenie wspornika

1. Umieść świeżo oddzielony płatek miki przytwierdzony do metalowego dysku podłóżkowego AFM na namagnesowanym uchwycie próbki, znajdującym się na płycie mocującej AFM. Ta konfiguracja posłuży do ustawienia głowicy AFM przed obrazowaniem próbki DNA lub białka przygotowanej w kroku 1.
   1. Uwaga techniczna: Namagnesowany uchwyt próbki oraz uchwyt sondy do komórki cieczowej są grubsze niż inne mechanizmy mocowania próbek i uchwyty sond. Jeśli obecnie prześwit między zespołem mika-uchwyt próbki a głowicą AFM jest niewystarczający, przesuń głowicę AFM w górę, kilkakrotnie wybierając ikonę wycofania (withdraw) w oprogramowaniu urządzenia.
2. Obróć płytę mocującą AFM tak, aby dysk z próbką był ustawiony do wstępnego obrazowania. Upewnij się, że podłoże z miki znajduje się w centrum pod głowicą AFM.
3. Przesuń głowicę AFM w dół w kierunku powierzchni dysku z miką, korzystając z funkcji sterowania ostrością powierzchni w oprogramowaniu urządzenia. Wybierz średnią (M) prędkość silnika Z i zbliżaj się do powierzchni, aż głowica AFM znajdzie się około 2 mm nad miką. W tym momencie przełącz się na wolną (S) prędkość silnika Z, aby uniknąć gwałtownego kontaktu sondy z powierzchnią (tzw. uderzenia końcówki).
4. Kontynuuj zbliżanie sondy do powierzchni podłoża z miki, aż wyraźne cechy powierzchni miki lub odbicie końcówki zostaną ustawione w ostrości. Przełączaj się między płaszczyznami ogniskowymi powierzchni i odbicia końcówki, korzystając z ikony „focus on:” w oprogramowaniu urządzenia.
5. Wybierz ikonę strojenia w oprogramowaniu urządzenia i nastroj wspornik. Częstotliwość rezonansowa zalecanych sond z wspornikami SNL i MSNL wynosi 20-60 kHz. Wybierz 5% przesunięcia szczytu (peak offset). Uwaga techniczna: Odpowiednie strojenie wspornika jest niezbędne do prawidłowego obrazowania próbki.

5. Obrazowanie powierzchni próbki miki

1. Przystaw sondę do powierzchni miki. Ustaw początkowy rozmiar skanowania na 10 μm oraz szybkość skanowania na 1 Hz. Wzmocnienie całkowe i proporcjonalne można początkowo ustawić odpowiednio na 0,2 i 0,4. Dostosuj wartości wzmocnień tak, aby skany w przód i w tył (trace i retrace) w przybliżeniu na siebie nachodziły. Zmniejszenie wartości zadanej amplitudy zwiększy oddziaływanie między sondą a miką i zapewni prawidłowy kontakt.
2. Wykonaj pełne obrazy skanowania pola o rozmiarze 10 μm. Zmniejsz rozmiar skanowania do 5, 1 i 0,5 μm, a następnie wykonaj pełne obrazy każdego z tych pól. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienia i szybkość skanowania. Wykonanie obrazów powierzchni miki stanowi punkt odniesienia do porównania z próbkami zawierającymi DNA i białka.
3. Odsuń sondę, klikając raz ikonę odsuwania (disengage) w oprogramowaniu urządzenia.

6. Obrazowanie interesujących biomolekuł

1. Delikatnie wymieszać próbkę DNA lub białka przygotowaną w kroku 1 i przygotować ją do naniesienia na obrazowaną powierzchnię miki. Wymieszać 5 μl przygotowanej próbki z 45 μl świeżego buforu adsorpcyjnego (końcowe stężenie próbki = 0,5 μg/ml).
2. Ostrożnie nanieść 50 μl roztworu zawierającego biomolekuły o stężeniu 0,5 μg/ml bezpośrednio na powierzchnię miki. Należy to zrobić bez przesuwania sondy lub głowicy AFM, upewniając się, że roztwór próbki (ale nie końcówka pipety) styka się z sondą.
3. Odczekać 5 minut, aby umożliwić biomolekułom w próbce przywieranie do powierzchni miki.
4. Po upływie 5 minut nanieść pipetą dodatkowe 50-10 μl buforu adsorpcyjnego do uchwytu sondy w celi płynnej, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety sondy, głowicy AFM ani miki. Pozwoli to na utworzenie menisku i umożliwi obrazowanie w trybie stukającym (tapping mode) AFM w cieczy. Rysunek 3 przedstawia końcowy układ celi płynnej, wspornika, próbki, uchwytu próbki oraz menisku.
5. W razie potrzeby ponownie ustawić fotodetektor i wyrównać laser względem wspornika. Uwaga techniczna: obserwacja końcówki sondy i wyrównanie lasera są utrudnione ze względu na wzór dyfrakcyjny powstający po dodaniu buforu próbki do uchwytu sondy. W razie potrzeby ręcznie nastroić wspornik.
6. Ponownie wprowadzić sondę do kontaktu, korzystając z oprogramowania urządzenia. W razie potrzeby dostosować ugięcie pionowe, wzmocnienie całkowe (integral gain) i wzmocnienie proporcjonalne (proportional gain). Rozpocznie to proces ponownego obrazowania fragmentu miki skanowanego bezpośrednio przed dodaniem próbki i przechwytywanie obrazów.
7. Zwiększyć zakres skanowania (50 nm-10 μm), aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Powiększyć obraz i zmniejszyć szybkość skanowania do 0,5 Hz w celu poprawy rozdzielczości obrazu.
8. Po zakończeniu obrazowania wycofać sondę, kilkakrotnie klikając ikonę wycofania w oprogramowaniu urządzenia. Przed demontażem celi płynnej lub dysku z próbką upewnić się, że zachowano wystarczający odstęp między głowicą AFM a dyskiem z próbką.
9. Dokładnie wypłukać uchwyt sondy celi płynnej oraz dysk z próbką wodą destylowaną, aby zapobiec tworzeniu się kryształów soli podczas odparowywania pozostałości buforu adsorpcyjnego. Osuszyć sprężonym powietrzem.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady obrazów AFM przedstawiono na Rysunku 4. Podłoże z miki (A) zapewnia powierzchniowo płaską strukturę molekularną, na której mogą adsorbować się DNA i białka. Obrazowanie miki przed analizą próbek biomolekuł służy jako kontrola negatywna i pozwala na ocenę szumu obrazowania. Zapewnia to również pewność, że wspornik jest odpowiednio nastrojony i że późniejsze obrazowanie próbek przebiegnie pomyślnie. Dwuniciowe plazmidowe DNA (B, D), prawdopodobnie superzwinięte, jest łatwo identyfikowalne dzięki asymetrycznemu wyglądowi i jednorodnemu osadzaniu się na wcześniej niepozbawionym cech charakterystycznych podłożu z miki. Kompleksy białkowe o określonych rozmiarach cząsteczek (C, E) są również wyraźnie odróżnialne od podłoża z miki. Różnice w wielkości cząsteczek wskazują na heterogeniczność próbki i mogą być przydatne przy szacowaniu stechiometrii kompleksów białkowych lub ich aktywności biochemicznej. Ogólny kształt diagonalny i spójna orientacja cząsteczek białkowych zaobserwowana w panelu C jest artefaktem obrazowania, ponieważ białka powinny orientować się na podłożu z miki w sposób losowy. Możliwymi przyczynami zaobserwowanego artefaktu są fizyczne uszkodzenie końcówki lub zbyt szybka prędkość skanowania podczas obrazowania AFM. Chociaż splot końcówki (zilustrowany na Rysunku 1B) uniemożliwia dokładne obliczenia długości w osiach x i y, pomiary wysokości (oś z) oraz względne pomiary w osiach x i y mogą być niemniej jednak użyteczne do szacowania właściwości biofizycznych obrazowanych biomolekuł.

Rycina 1: Schematyczny przedstawienie mikroskopii sił atomowych (AFM) w trybie stukowym. A, mikroskop. Na końcu wspornika znajduje się ostra końcówka, która oscyluje w pionie podczas skanowania powierzchni podłoża z miki, do którego adsorbują się kompleksy biomolekularne. Podczas ruchu skanera w kierunkach x i y wiązka lasera jest odbijana od tylnej części wspornika na detektor w postaci fotodiody czułej na pozycję, co pozwala na mapowanie odległości w pionie (z), o jaką przemieszcza się końcówka, przechodząc nad kompleksami biomolekularnymi osadzonymi na mice. B. Zniekształcenie obrazu w kierunkach x i y spowodowane splotem końcówki. Nominalny promień konwencjonalnej końcówki z azotku krzemu jest większy niż cząstki poddawane obrazowaniu, a krawędź końcówki styka się z próbką podczas przesuwania się po powierzchni. Splot końcówki powoduje, że obrazowane cząstki wydają się większe w kierunkach x i y, ale nie w kierunku z. Efekt ten można zminimalizować, stosując końcówki o mniejszym promieniu nominalnym.

Rysunek 2: Ilustracja przygotowania próbek białek i DNA po immunoadsorpcji. A, Uwalnianie immunoadsorbowanego kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu przeciwciała monoklonalnego (mAb)-białko A-Sepharose (PAS). Inkubacja immunoosadu z peptydem zawierającym epitop mAb ułatwi uwolnienie kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu, co pozwoli na zebranie kompleksu z supernatantu i jego wizualizację za pomocą AFM. B, Przygotowanie DNA do obrazowania AFM wymaga zastosowania buforu adsorpcyjnego z kationami dwuwartościowymi. Kation dwuwartościowy zwiększa powinowactwo DNA do podłoża z miki.

Rysunek 3: Końcowy układ głowicy AFM, uchwytu sondy celi cieczowej, próbki, uchwytu preparatu oraz menisku buforu. A, Należy zachować ostrożność podczas nakładania próbki i dodatkowego buforu na podłoże z miki, aby uniknąć kontaktu fizycznego końcówki pipety z głowicą AFM, celą cieczową i podłożem z miki. B, Powiększenie A. Menisk buforu rozciąga się od dysku z preparatem do uchwytu sondy celi cieczowej.

Rycina 4: Mikrografie sił atomowych podłoża z miki (A), plazmidowe DNA 2xGal4-2xGRE-lucyferaza ⁸ (B, D) oraz kompleksów białkowych GR•hsp70 (C, E) w roztworze buforowym. Mika służy jako obraz kontrolny do porównania z wizualizacjami DNA i białek. Kompleksy białkowe GR•hsp70 przygotowano poprzez immunoadsorpcję GR z dodatkiem hsp70, a następnie uwolniono je z osadu przeciwciał na kuleczkach, stosując konkurencyjne przeciwciało mAb (przedstawiono na Rysunku 2A). DNA przygotowano za pomocą konwencjonalnej metody miniprep plazmidów. Panele A, B i C mają takie samo powiększenie (skala = 20 nm), podobnie jak panele D i E (skala = 40 nm).

Dyskusja

AFM stanowi wyjątkową technikę mikroskopową umożliwiającą obrazowanie pojedynczych, niepowlekanych biomolekuł w czasie rzeczywistym w roztworach wodnych i buforach zbliżonych do fizjologicznych. Pozwala to na wizualizację pojedynczych białek i cząsteczek DNA, a także kompleksów wielobiałkowych oraz kompleksów białko-DNA. Obrazowanie cząsteczek makromolekularnych za pomocą AFM może być przydatne do oceny homogeniczności próbki oraz identyfikacji fizycznego rozmieszczenia komponentów tworzących obserwowane cząstki. Takie podejście, polegające na obserwacji pojedynczych cząsteczek makromolekularnych, może stanowić użyteczne uzupełnienie konwencjonalnych technik biochemicznych, takich jak testy immunoprecypitacji, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym oraz chromatografia wykluczania, które dostarczają istotnych danych sumarycznych reprezentujących 10³-10¹¹ pojedynczych, interesujących badacza kompleksów biomolekularnych obecnych w próbce.

Badania nad stechiometrią kompleksów multiproteinowych, oddziaływaniami biomolekularnymi oraz zapotrzebowaniem na kofaktory mogą być prowadzone z wykorzystaniem AFM. Przedstawiona tutaj metoda może zostać dostosowana do specyficznych pytań biofizycznych. Na przykład, stosując uchwyt sondy z komorką cieczową umożliwiającą wymianę buforu, można badać zapotrzebowanie na kofaktory niezbędne do formowania się kompleksów białkowych. Zespoły DNA-białko mogą być tworzone i dysocjowane niemal w czasie rzeczywistym, nawet w trakcie obrazowania. Można generować DNA o konkretnych, interesujących sekwencjach (np. domniemanych elementach odpowiedzi lub nowych sekwencjach wiązania białek), mieszać je z hipotetycznym białkiem wiążącym i obrazować, aby dostarczyć bezpośrednich dowodów na oddziaływania międzycząsteczkowe.

Obrazowanie AFM w trybie stukowym jest znacznie mniej skomplikowane w przypadku wykorzystania próbek suchych niż próbek w roztworach wodnych; w ten sposób obrazowano zarówno liniowe nici DNA, jak i plazmidy DNA o strukturze zamkniętego koła ^3,9. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu wykorzystuje próbki w roztworach buforowych, aby zapewnić bardziej fizjologiczne środowisko obrazowania. Należy również rozważyć inne istotne metody obrazowania białek, w tym bliskopolową mikroskopię w podczerwieni ¹⁰. Komplementarne zastosowanie immunoadsorpcji wraz z AFM daje możliwość przygotowania wielu kompleksów białkowych przy użyciu uznanych technik biochemicznych, a następnie ich wizualizacji po uwolnieniu z osadu przeciwciał związanych z kuleczkami. Na przykład, z zastosowaniem tego podejścia analizowano immunoadsorbowany GR pod kątem jego asocjacji z białkiem opiekuńczym hsp70 ¹ oraz białkiem motorowym dyneiną ², w celu oszacowania wielkości i stechiometrii kompleksów. Wielkość cząstek oraz cechy biofizyczne (np. sztywność) okazały się pomocne w ustaleniu tożsamości biomolekuł obserwowanych w próbkach obrazowanych za pomocą AFM ^11,12. Możliwe jest również potwierdzenie tożsamości biomolekuły poprzez dodanie oddziałującej biomolekuły (np. ligandu lub przeciwciała monoklonalnego), która związałaby się ze swoim celem i spowodowała zwiększenie rozmiaru cząstki, jeżeli docelowa biomolekuła jest obecna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dimension 3100	Bruker Corporation	Dimension 3100
Komora przepływowa Dimension Fluid Cell	Bruker Corporation	DTFML-DD-HE
Sonda AFM z azotku krzemu Sharp nitride lever (SNL)	Bruker Corporation	SNL-10
Sonda AFM z azotku krzemu Microlever sharp nitride lever (MSNL)	Bruker Corporation	MSNL-10
Oprogramowanie instrumentu NanoScope AFM	Bruker Corporation	004-132-000
Metalowe podkładki do próbek AFM	Ted Pella, Inc.	16208
Podkładki z miki klasy V1, 12 mm	Ted Pella, Inc.	50-12