Wizualizacja rekombinowanych kompleksów DNA i białek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Summary

Opisano metodę mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie opukiwania do wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych i kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po manipulacji biochemicznej. DNA zawierające określone regiony oddziałujące z białkami obserwuje się w warunkach zbliżonych do fizjologicznych warunków buforowych.

Abstract

Mikroskopia sił atomowych (AFM) pozwala na wizualizację pojedynczych białek, cząsteczek DNA, kompleksów białko-białko i kompleksów DNA-białko. Na końcu wspornika mikroskopu znajduje się sonda w skali nano, która przemierza obszary obrazu w zakresie od nanometrów do mikrometrów, mierząc wysokość makrocząsteczek spoczywających na powierzchni podłoża w dowolnym punkcie. Siły elektrostatyczne powodują, że białka, lipidy i kwasy nukleinowe luźno przyczepiają się do podłoża w losowych orientacjach i umożliwiają obrazowanie. Wygenerowane dane przypominają mapę topograficzną, na której makrocząsteczki rozdzielają się jako trójwymiarowe cząstki o dyskretnych rozmiarach (rysunek 1) ^1,2. Tryb gwintowania AFM polega na wielokrotnym oscylowaniu wspornika, co umożliwia obrazowanie stosunkowo miękkich biomateriałów, takich jak DNA i białka. Jedną z godnych uwagi zalet AFM w porównaniu z innymi technikami mikroskopii w nanoskali jest jej względna zdolność adaptacji do wizualizacji pojedynczych białek i kompleksów makromolekularnych w wodnych, w tym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, w czasie rzeczywistym i bez barwienia lub powlekania próbki, która ma być zobrazowana.

Metoda przedstawiona tutaj opisuje obrazowanie DNA i immunoadsorbowanego czynnika transkrypcyjnego (tj. receptora glukokortykoidowego, GR) w roztworze buforowym (Rysunek 2). Immunoadsorbowane białka i kompleksy białkowe można oddzielić od immunoadsorbującego osadu przeciwciało-kulki poprzez konkurencję z epitopem przeciwciała, a następnie zobrazować (Figura 2A). Pozwala to na biochemiczną manipulację interesującymi biomolekułami przed obrazowaniem. Po oczyszczeniu DNA i białka można wymieszać, a powstały kompleks oddziałujący można również zobrazować. Wiązanie DNA z miką wymaga dwuwartościowego kationu ³, takiego jak Ni^{2 +} lub Mg^{2 +}, który można dodać do próbki, zachowując jednocześnie aktywność białka. Stosując podobne podejście, AFM wykorzystano do wizualizacji pojedynczych enzymów, w tym polimerazy RNA ⁴ i enzymu naprawczego ⁵, związanych z pojedynczymi niciami DNA. Eksperymenty te dostarczają istotnych informacji na temat biofizycznych oddziaływań białko-białko i DNA-białko zachodzących na poziomie molekularnym. Obrazowanie pojedynczych cząstek wielkocząsteczkowych za pomocą AFM może być przydatne do określenia jednorodności cząstek i identyfikacji fizycznego układu składników składowych obrazowanych cząstek. Chociaż obecna metoda została opracowana do wizualizacji kompleksów białkowych GR-chaperonu ^1,2 i nici DNA, z którymi GR może się wiązać, może być szeroko stosowana do obrazowania próbek DNA i białek z różnych źródeł.

Protocol

1. Przygotowanie próbek DNA i białek do obrazowania wolnego od zanieczyszczeń

1. Wyizolować biomolekuły do zobrazowania i umieścić w odpowiednim buforze wodnym. Białka, które mają być zobrazowane, mogą być oczyszczane za pomocą chromatografii cieczowej ⁶, immunoadsorpcji, a następnie usunięcia przeciwciała i osadu ^1,2 lub oczyszczania Profinity eXact i usuwania znaczników ⁷ (Figura 2A). Wyizoluj cząsteczki DNA, które mają być zobrazowane przez oczyszczanie miniprep (Figura 2B).
2. Potwierdź skład i czystość próbek białek, które mają być zobrazowane za pomocą SDS-PAGE i western blot. W przypadku DNA potwierdź sekwencję i czystość, przeprowadzając trawienie restrykcyjne i elektroforezę w żelu agarozowym.
3. Inkubować próbki w buforze adsorpcyjnym AFM, aby ułatwić przyleganie próbki do miki. W przypadku próbek białkowych można zastosować 10 mM bufor HEPES. Można również dodać dodatkowe sole o niskiej sile jonowej lub inne kofaktory. W przypadku próbek DNA należy dołączyć kation dwuwartościowy (np. Mg²⁺ lub Ni²⁺) w celu pobudzenia adsorpcji na substracie miki. Odpowiednim buforem zawierającym Mg²⁺ dla DNA jest 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ ³. Alternatywnym buforem Ni²⁺ jest 10 mM HEPES, pH 6,8, 10 mM NiCl₂.
4. Rozcieńczyć próbkę do stężenia 5 μg/ml w buforze adsorpcyjnym. Delikatnie wymieszaj. Przechowywać na lodzie podczas przygotowywania mikroskopu.

2. Montaż sondy AFM

1. Umieść uchwyt sondy z komórką cieczową na odpowiedniej stacji dokującej do instalacji wspornikowej.
2. Zlokalizuj długi, gruby wspornik (określany jako wspornik "B") sondy z ostrą dźwignią azotkową (SNL), która ma być używana do obrazowania. Ostrożnie przenieś go do uchwytu sondy z płynnymi komórkami, upewniając się, że końcówka pozostaje w pozycji pionowej. Uwaga techniczna: Podczas transportu sondy należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ upuszczenie jej z dowolnej wysokości może uszkodzić lub zniszczyć wspornik lub końcówkę. Sonda mikrodźwigniowa SNL (MSNL) może być używana jako alternatywa dla sondy SNL.
3. Wyjmij uchwyt sondy ze stacji dokującej i zbadaj wspornik pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że jest nienaruszony i prawidłowo osadzony w uchwycie sondy z ogniwami cieczowymi.
4. Ostrożnie wyjmij głowicę AFM z zespołu jaskółczego ogona przyrządu, dokręcając radełkowany clamp śruba. Uwaga techniczna: Podczas manipulowania głowicą AFM należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ upuszczenie jej nawet z niewielkiej odległości (np. jeśli nie jest prawidłowo osadzona w zespole jaskółczego ogona) może spowodować znaczne uszkodzenia.
5. Odwróć głowicę AFM i mocno wciśnij uchwyt sondy z płynną komórką na cztery kołki u podstawy głowicy AFM. Ostrożnie włóż głowicę AFM do zespołu jaskółczego ogona przyrządu. Odkręć radełkowany clamp śruba, aby przymocować głowicę AFM do instrumentu.

3. Lokalizowanie końcówki wspornika, wyrównywanie lasera i regulacja fotodetektora

1. Korzystając z oprogramowania przyrządu AFM, zlokalizuj końcówkę wspornika, przesuwając pokrętła wbudowanego mikroskopu świetlnego. W razie potrzeby dostosuj oświetlenie mikroskopu, aby poprawić identyfikację końcówki. Umieść koniec końcówki wspornika w pobliżu krzyża nitkowego wyświetlanego w oprogramowaniu przyrządu.
2. Ustaw ostrość końcówki wspornika, regulując strzałki w górę iw dół kontrolera optyki w oprogramowaniu. Podczas regulacji optyki używaj niskiej (S) lub średniej (M) prędkości.
3. Dopasuj laser do końcówki wspornika za pomocą pokręteł regulacji lasera. Przesuwaj pokrętła regulacyjne, aż czerwona kropka lasera znajdzie się w białym punkcie podświetlenia. Śledź wzdłuż ramienia wspornika za pomocą zygzakowatego wzoru, aż laser zostanie umieszczony na końcówce wspornika. Po prawidłowym ustawieniu w przedniej szybie głowicy AFM pojawi się silny punkt odbicia.
4. Wyśrodkuj fotodetektor, regulując pokrętła fotodetektora na głowicy AFM. Spowoduje to wyrównanie kropki laserowej na krzyżyku ekranu fotodetektora w oprogramowaniu instrumentu. Obserwowana suma sygnałów powinna wynosić około 4-6.

4. Pozycjonowanie głowicy AFM i kantylu strojenia

1. Umieść świeżo rozcięty arkusz miki przymocowany do metalowego krążka próbki AFM na namagnesowanym uchwycie próbki na górze płytki uchwytu AFM. Ta konfiguracja zostanie wykorzystana do ustawienia głowicy AFM przed obrazowaniem próbki DNA lub białka przygotowanej w kroku 1.
   1. Uwaga techniczna: Namagnesowany uchwyt próbki i uchwyt sondy z płynną kują są grubsze niż inne mechanizmy mocowania próbek i uchwyty sondy. Jeśli obecnie nie ma wystarczającego odstępu między zespołem uchwytu próbki miki a głowicą AFM, przesuń głowicę AFM do góry, kilkakrotnie wybierając ikonę wycofania w oprogramowaniu przyrządu.
2. Obróć płytkę mocującą AFM tak, aby krążek próbki znalazł się w pozycji do wstępnego obrazowania. Upewnij się, że podłoże mikowe jest wyśrodkowane pod głowicą AFM.
3. Przesuń głowicę AFM w dół w kierunku powierzchni krążka próbki miki, korzystając z kontroli powierzchni ostrości w oprogramowaniu instrumentu. Wybierz średnią (M) prędkość silnika Z i kontynuuj w kierunku powierzchni, aż głowica AFM znajdzie się około 2 mm nad miką. W tym momencie przełącz się na niską prędkość silnika (S) Z, aby uniknąć nagłego kontaktu sondy z powierzchnią (określanego jako awaria końcówki).
4. Kontynuuj przesuwanie sondy bliżej powierzchni podłoża mikowego, aż wyraźne cechy na powierzchni miki lub odbicie końcówki będą ostre. Przełączaj się między płaszczyznami ogniskowymi odbicia powierzchni i końcówki za pomocą ikony "ostrości na:" w oprogramowaniu instrumentu.
5. Wybierz ikonę strojenia w oprogramowaniu instrumentu i nastroić wspornik. Częstotliwość rezonansowa zalecanych sond wspornikowych SNL i MSNL wynosi 20-60 kHz. Wybierz przesunięcie szczytowe o 5%. Uwaga techniczna: Odpowiednie strojenie wspornika jest niezbędne do odpowiedniego obrazowania próbki.

5. Obrazowanie powierzchni próbki miki

1. Przymocuj sondę do powierzchni miki. Ustaw początkowy rozmiar skanowania na 10 μm, a częstotliwość skanowania na 1 Hz. Wzmocnienie całkujące i wzmocnienie proporcjonalne można początkowo ustawić odpowiednio na 0,2 i 0,4. Dostosuj wzmocnienia zgodnie z potrzebami, aby skany śledzenia i śledzenia z grubsza się pokrywały. Zmniejszenie nastawy amplitudy zwiększy interakcję między sondą a miką i zapewni zaangażowanie.
2. Rejestruj pełne obrazy skanowania pola 10 μm. Zmniejsz rozmiar skanu do 5, 1 i 0,5 μm i uchwyć pełne obrazy każdego pola. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienia i szybkość skanowania. Uchwycenie obrazów powierzchni miki stanowi punkt odniesienia do porównania z próbkami zawierającymi DNA i białka.
3. Odłącz sondę jednym kliknięciem ikony rozłączania w oprogramowaniu przyrządu.

6. Obrazowanie interesujących biomolekuł

1. Delikatnie wymieszaj próbkę DNA lub białka przygotowaną w kroku 1 i przygotuj się do załadowania jej na obrazowaną powierzchnię miki. Zmieszać 5 μl przygotowanej próbki z 45 μl świeżego buforu adsorpcyjnego (stężenie próbki końcowej = 0,5 μg/ml).
2. Ostrożnie dodać 50 μl roztworu zawierającego biomolekuły o stężeniu 0,5 μg/ml bezpośrednio na powierzchnię miki. Zrób to bez przesuwania sondy lub głowicy AFM i upewnij się, że roztwór próbki (ale nie końcówka pipety) styka się z sondą.
3. Zatrzymaj się na 5 minut, aby biomolekuły w próbce przylgnęły do powierzchni miki.
4. Po upływie 5 minut odpipetować dodatkowe 50-100 μl buforu adsorpcyjnego do uchwytu sondy z kuwetą cieczową, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety sondy, głowicy AFM ani miki. Utworzy to łąkotkę i umożliwi obrazowanie w trybie opukiwania AFM w płynie. Rysunek 3 przedstawia ostateczny układ celi płynu, wspornika, próbki, uchwytu próbki i menisku.
5. Wyreguluj fotodetektor i w razie potrzeby ustaw laser na wsporniku. Uwaga techniczna: view końcówka sondy i wyrównanie lasera jest skomplikowane ze względu na wzór dyfrakcyjny spowodowany dodaniem bufora próbki do uchwytu sondy. W razie potrzeby ręcznie przestroić wspornik.
6. Ponownie podłącz sondę za pomocą oprogramowania przyrządu. W razie potrzeby dostosuj ugięcie pionowe, wzmocnienie całkujące i wzmocnienie proporcjonalne. Spowoduje to rozpoczęcie procesu ponownego obrazowania fragmentu miki zeskanowanego bezpośrednio przed dodaniem próbki i przechwyceniem obrazów.
7. Zwiększ rozmiar skanu (500 nm-10 μm), aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Powiększ i zmniejsz częstotliwość skanowania do 0,5 Hz, aby poprawić rozdzielczość obrazu
8. Po zakończeniu obrazowania odłącz sondę, kilkakrotnie wybierając ikonę wycofania w oprogramowaniu instrumentu. Upewnij się, że jest wystarczający odstęp między głowicą AFM a tarczą próbki przed demontażem kuwety z cieczą lub krążka z próbką.
9. Dokładnie przepłucz uchwyt sondy z cieczą i krążek próbki wodą destylowaną, aby zapobiec tworzeniu się kryształków soli podczas odparowywania resztkowego buforu adsorpcyjnego. Wysuszyć sprężonym powietrzem.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady obrazów AFM są przedstawione na rysunku 4. Substrat miki (A) zapewnia molekularnie płaską powierzchnię, na której DNA i białko mogą się adsorbować. Obrazowanie miki przed próbkami biomolekuł zapewnia negatywną kontrolę i ocenę szumu obrazowania. Zapewnia również pewien poziom pewności, że wspornik jest odpowiednio dostrojony, a późniejsze obrazowanie próbki zakończy się sukcesem. Dwuniciowy plazmid DNA (B, D), przypuszczalnie superskręcony, jest łatwo identyfikowany po jego asymetrycznym wyglądzie i równomiernym osadzaniu się na wcześniej niepozornym podłożu mikowym. Kompleksy białkowe o dyskretnych rozmiarach cząstek (C, E) są również wyjątkowo odróżnialne od substratu miki. Różnice w wielkości cząstek wskazują na niejednorodność próbki i mogą być przydatne do przybliżenia stechiometrii kompleksu białek lub aktywności biochemicznej. Ogólny kształt przekątnej i konsekwentna orientacja cząstek białka zaobserwowanych w Panelu C jest artefaktem obrazowania, ponieważ oczekuje się, że białka będą zorientowane na podłożu miki w sposób losowy. Możliwymi przyczynami zaobserwowanego artefaktu jest fizyczna nieprawidłowość końcówki lub obrazowanie AFM przy zbyt dużej szybkości skanowania. Podczas gdy konwolucja końcówki (zilustrowana na rysunku 1B) uniemożliwia obliczenia bezwzględnego pomiaru długości w osiach x i y, pomiar wysokości (oś z) oraz względne pomiary x i y mogą być jednak przydatne do oszacowania właściwości biofizycznych obrazowanych biomolekuł.

Rysunek 1: Schematyczna prezentacja mikroskopii sił atomowych w trybie gwintowania (AFM). A, mikroskop. Na końcu wspornika znajduje się ostra końcówka, która oscyluje w górę iw dół, skanując powierzchnię substratu mikowego, do którego adsorbują się kompleksy biomolekularne. Gdy skaner porusza się w kierunkach x i y, wiązka laserowa jest odbijana od tyłu wspornika na czuły na położenie detektor fotodiodowy w celu zmapowania pionowej (z) odległości, na jaką porusza się końcówka, przechodząc nad kompleksami biomolekularnymi osadzonymi na mice. B. Zniekształcenie obrazu w kierunkach x i y spowodowane splotem końcówki. Promień nominalny konwencjonalnej końcówki z azotku krzemu jest większy niż cząstki, które mają być zobrazowane, a krawędź końcówki styka się z próbką podczas jej przechodzenia przez powierzchnię. Konwolucja końcówki powoduje, że obrazowane cząstki wydają się większe w kierunkach x i y, ale nie w kierunku z. Efekt ten można zminimalizować poprzez zastosowanie końcówek o mniejszym nominalnym promieniu końcówki.

Rysunek 2: Ilustracja przygotowania immunoadsorbowanego białka i próbki DNA. A, Uwalnianie immunoadsorbowanego kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu przeciwciała monoklonalnego (mAb)-białka A-Sepharose (PAS). Inkubacja immunogranulki z peptydem zawierającym epitop mAb ułatwi uwalnianie kompleksu białkowego GR•hsp70 z osadu, umożliwiając pobranie kompleksu z supernatantu i wizualizację przez AFM. B, Przygotowanie DNA do obrazowania AFM wymaga użycia buforu adsorpcyjnego kationów dwuwartościowych. Kation dwuwartościowy zwiększa powinowactwo DNA do substratu miki.

Rysunek 3: Końcowy układ głowicy AFM, uchwytu sondy do komórek płynnych, próbki, uchwytu próbki i menisku buforowego. A, Należy zachować ostrożność podczas umieszczania próbki i dodatkowego buforu na podłożu miki, aby uniknąć fizycznego kontaktu między końcówką pipety a głowicą AFM, płynem i substratem mikowym. B, Powiększenie A. Menisk buforowy rozciąga się od krążka próbki do uchwytu sondy z płynną komórką.

Rysunek 4: Mikrofotografie sił atomowych substratu miki (A), kompleksów białkowych 2xGal4-2xGRE-lucyferaza plazmidu ^{DNA 8} (B, D) i GR•hsp70 (C, E) w roztworze buforowanym. Mika służy jako obraz kontrolny do porównania z wizualizacjami DNA i białka. Kompleksy białkowe GR•hsp70 przygotowano przez immunoadsorpcję GR zaszczepionego hsp70, a następnie uwolniono z osadu przeciwciało-kulka przy użyciu konkurencyjnego przeciwciała mAb (zilustrowanego na rycinie 2A). DNA przygotowano za pomocą konwencjonalnego minipreparu plazmidowego. Panele A, B i C mają równoważne powiększenie (podziałka = 200 nm), podobnie jak panele D i E (podziałka = 40 nm).

Discussion

AFM zapewnia unikalną technikę mikroskopową zdolną do obrazowania pojedynczych niepowlekanych biomolekuł w wodnych i prawie fizjologicznych roztworach buforowych w czasie rzeczywistym. Pozwala to na wizualizację pojedynczych białek i cząsteczek DNA, a także kompleksów wielobiałkowych i kompleksów białko-DNA. Obrazowanie cząstek wielkocząsteczkowych za pomocą AFM może być przydatne do oceny jednorodności próbki i identyfikacji fizycznego układu składników składowych obserwowanych cząstek. To podejście polegające na obserwacji pojedynczych cząstek makromolekularnych może być użytecznym uzupełnieniem konwencjonalnych technik biochemicznych, takich jak testy immunoprecypitacji, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym i chromatografia kolumnowa wykluczająca rozmiar, które dostarczają istotnych danych podsumowujących reprezentujących 10^{3-10 11} indywidualnych kompleksów biomolekularnych będących przedmiotem zainteresowania obecnych w próbce.

Badania nad stechiometrią kompleksu wielobiałkowego, interakcjami biomolekularnymi i wymaganiami dotyczącymi kofaktorów można badać za pomocą AFM. Przedstawiona tu metoda może być dostosowana do konkretnych zagadnień biofizycznych, które są przedmiotem zainteresowania. Na przykład, przy użyciu uchwytu sondy z ciekłymi komórkami zdolnego do wymiany buforu, możliwe jest określenie wymagań dotyczących kofaktora dla tworzenia kompleksów białkowych. Zespoły DNA-białko mogą być formowane i dysocjowane w czasie zbliżonym do rzeczywistego, a nawet podczas obrazowania. DNA można wygenerować z określonymi sekwencjami będącymi przedmiotem zainteresowania (np. przypuszczalnymi elementami odpowiedzi lub nową sekwencją wiążącą białko), zmieszane z hipotetycznym białkiem wiążącym i zobrazowane w celu dostarczenia bezpośrednich dowodów na interakcje międzycząsteczkowe.

Obrazowanie AFM w trybie stukania jest znacznie mniej skomplikowane, jeśli wykorzystuje się suche próbki, a nie próbki w roztworach wodnych, a liniowe podstawki DNA i plazmidy DNA o zamkniętym okręgu zostały zobrazowane w ten sposób ^3,9. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje próbki w roztworach buforowych w celu zapewnienia bardziej fizjologicznego środowiska obrazowania. Należy również rozważyć inne godne uwagi metody obrazowania białek, w tym mikroskopię w podczerwieni bliskiego pola ¹⁰. Komplementarne zastosowanie immunoadsorpcji w połączeniu z AFM daje możliwość przygotowania niezliczonych kompleksów białkowych przy użyciu dobrze znanych technik biochemicznych, a następnie wizualizacji ich po uwolnieniu z immunoadsorbującego osadu przeciwciało-kulka. Na przykład immunoadsorbowany GR został oceniony pod kątem jego związku z molekularnym białkiem opiekuńczym hsp70 ¹ oraz białkiem motorycznym dyneiny ² przy użyciu tego podejścia w celu oszacowania złożonej wielkości i stechiometrii. Wielkość cząstek i cechy biofizyczne (np. sztywność) okazały się przydatne w ustaleniu tożsamości biomolekuł zaobserwowanych w próbkach zobrazowanych AFM ^11,12. Możliwe jest również potwierdzenie tożsamości biomolekuły poprzez dodanie oddziałującej biomolekuły (np. liganda lub przeciwciała monoklonalnego), która związałaby się ze swoim celem i spowodowałaby wzrost wielkości cząstek, jeśli docelowa biomolekuła jest obecna.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimension 3100	Bruker Corporation	Dimension 3100
Dimension Fluid Cell	Bruker Corporation	DTFML-DD-HE
Ostra dźwignia azotku (SNL) Sonda AFM z azotku krzemu	Bruker Corporation	SNL-10
Microlever ostra dźwignia azotkowa (MSNL) z azotku krzemu Sonda AFM	Bruker Corporation	MSNL-10
NanoScope AFM oprogramowanie do instrumentów	Bruker Corporation	004-132-000
Metalowe tarcze do próbek AFM	Ted Pella, Inc.	16208
Krążki mikowe klasy V1, 12 mm	Ted Pella, Inc.	50-12 Rozdział 50-12