Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wstrzyknięcie do-cysternowe myszom
UWAGA: Cała procedura jest wykonywana w komorze z przepływem laminarnym, aby utrzymać warunki aseptyki.
- Domowe myszy laboratoryjne (8-tygodniowe, samica Balb/c) w określonych warunkach wolnych od patogenów. Zapewnij granulki pokarmowe i wodę ad libitum.
- Umieść zwierzęta w nowym środowisku na 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu zważ i oceń temperaturę ciała.
nuta: Wsobne samice myszy Balb/c w wieku ośmiu tygodni ważą średnio około 19 g. Średnia temperatura myszy laboratoryjnych fizjologicznie waha się w granicach 36-38 °C.
- Odczepić zwierzę od szyi, oczyścić okolice brzucha 70% etanolem i wstrzyknąć ip dekstran żelaza (rozpuszczony w 1% buforze soli fizjologicznej, 250 mg/kg) w prawy dolny kwadrant mysiego brzucha za pomocą igły 25 G 0,5 mm x 16 mm, około 2-3 godziny przed zakażeniem.
nuta: Wstrzyknięcie dootrzewnowe wykonano w prawy dolny kwadrant mysiego brzucha, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej, takich jak pęcherz moczowy, jelito ślepe itp. Podawanie zwierzętom egzogennego źródła żelaza, w postaci dekstranu żelaza, przed zakażeniem sprzyja namnażaniu się bakterii w organizmie gospodarza.
- Po 2-3 godzinach należy wykonać znieczulenie zwierzęce ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (3 mg/kg) oraz lubrykantem okulistycznym.
- Sprawdź głębokość znieczulenia, upewniając się, że nie ma reakcji bólowej po uszczypnięciu palca u nogi.
- Ustaw mysz w odleżynie mostka i ostrożnie rozciągnij kończyny i kręgosłup szyjny, aby utrzymać kręgosłup w prostej pozycji.
- Delikatnie wymieszać zawiesinę bakteryjną, aby utrzymać stałą zawiesinę, przed załadowaniem strzykawki z igłą 30 G x 8 mm.
nuta: Przygotować zawiesinę bakteryjną jak najbliżej czasu wstrzyknięcia; W międzyczasie przechowuj go w temperaturze pokojowej.
- Na podstawie miana bakterii po rozmrożeniu (jtk/ml) należy przystąpić do obliczania całkowitej jtk, która ma być użyta, w odniesieniu do całkowitej liczby zwierząt, które mają być zakażone (dawka bakterii CFU na liczbę zwierząt). Przystąpić do obliczenia dokładnej objętości, która ma być pobrana z fiolki, aby uzyskać całkowitą jtkówkę, stosując proporcję między mianem bakterii po rozmrożeniu (jtk/ml) a całkowitym mianem bakteryjnym przydatnym do zakażenia n myszy (miano bakterii po rozmrożeniu CFU: ml = całkowita jtk: x). Ustalić ostateczną objętość w odniesieniu do całkowitej liczby zwierząt, które mają być zakażone.
nuta: W eksperymentach tych wykorzystano szeroki zakres mian od 104 do 109 na zwierzę.
- Oczyść obszar operacyjny 70% etanolem.
- Zidentyfikuj punkt wstrzyknięcia za pomocą igły i wstrzyknij ustalony CFU meningokoków (szczep dziki i izogeniczny zmutowany szczep) lub bulion GC uzupełniony dekstranem żelaza (5 mg/kg) jako kontrolę, w całkowitej objętości 10 μl do cisterna magna myszy przez otwór w kształcie zadziorów potylicznych, używając igły 30 G x 8 mm.
- Wykonaj inokulum cysternalne, umieszczając igłę na skrzyżowaniu czaszkowo-szyjkowym, a konkretnie w grzbietowej przestrzeni podpajęczynówkowej. Ventroflex głowicy, aby ta przestrzeń była dostępna.
- Krótko mówiąc, umieść zwierzę w pozycji leżącej, trzymaj uszy z dala od drogi i umiarkowanie zegnij szyję (90 do 100°). Upewnij się, że linia środkowa szyi i głowy (od nosa do potylicy) znajduje się w idealnie równoległej pozycji do blatu.
- Dotknij skrzydeł atlasu i upewnij się, że zachodzą na siebie, eliminując obrót osiowy. Naturalne wgłębienie można zwykle dotknąć na linii środkowej, gdzie igła najprawdopodobniej wejdzie do otworu potylicznego.
- Po wstrzyknięciu myszom leku Neisseria należy bezpiecznie wyrzucić strzykawkę i igłę.
- Umieść zwierzę w klatce i poczekaj na przebudzenie i pełne odzyskanie ruchu.
- Trzymaj klatki z zakażonymi myszami w komorze z przepływem laminarnym.
- Monitoruj myszy, 24 godziny po zakażeniu, pod kątem klinicznych objawów śpiączki zgodnie ze skalą śpiączki. Skala śpiączki: 1 = śpiączka, 2 = nie stoi pionowo po odwróceniu na plecy, 3 = stoi w pozycji pionowej w ciągu 30 s, 4 = stoi w pozycji pionowej w ciągu 5 s, minimalna aktywność ambulatoryjna, 5 = normalna.
nuta: Gdy u zwierząt stwierdzono ból, podawano znieczulenie meloksykamem (5 mg/kg domięśniowo przez cały czas trwania badania).
2. Przeżywalność zwierząt i liczba CFU
- Przetrwanie zwierząt
- Przygotować inokulację bakteryjną w różnych dawkach (od 10,4 do 10,9 jtk na mysz) w celu zakażenia zwierząt drogą zakaźną.
- W ten sam sposób zaszczepić myszy kontrolne bulionem GC, uzupełnionym dekstranem żelaza (5 mg/kg).
- Monitoruj zwierzęta pod kątem objawów klinicznych: potarganej sierści, zgarbionego wyglądu, hipotermii, utraty wagi, letargu lub konania codziennie przez cały eksperyment przez 168 godzin (7 dni) co najmniej dwa razy dziennie przez cały czas trwania eksperymentu.
- Codziennie mierz masę ciała i temperaturę za pomocą wagi cyfrowej i termometru doodbytniczego.
- Rejestruj przeżywalność myszy przez tydzień.
nuta: Rejestruj naturalną śmierć zwierzęcia po zakażeniu, podczas gdy zwierzęta, które osiągną wartość śpiączki 2 lub przeżyją ponad 168 godzin obserwacji, zostaną poddane eutanazji.
- Myszy ze śpiączką o wartości 2 lub które przeżyły w czasie obserwacji, znieczulić ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (3 mg/kg) i nałożyć maść okulistyczną.
- Sprawdź, czy reakcja bólowa jest nieobecna przez uszczypnięcie palca u nogi.
- Przeprowadzić eutanazję myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i zarejestrować je jako martwe do analizy statystycznej.
- Należy przeprowadzić test przeżywalności zwierzęcia lub test liczby CFU na zakażonych zwierzętach.