Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Źródło i obudowa myszy
- Wyprowadź myszy LysM-eGFP na tle genetycznym C57BL / 6J. Wyprowadź myszy LysM-EGFP×MyD88-/- przez skrzyżowanie myszy LysM-EGFP z myszami MyD88-/- na tle C57BL/6J.
- Myszy domowe w wiwarium. W tych badaniach zwierzęta były trzymane na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis w grupach przed operacją i w pojedynczych pomieszczeniach po operacji. Używaj myszy w wieku od 10 do 16 tygodni.
2. Przygotowanie i kwantyfikacja bakterii
- Usunąć interesujący nas bioluminescencyjny szczep S. aureus z magazynu w temperaturze -80 °C do rozmrożenia na lodzie. Smuga na 5% płytce z agarem z krwią bydlęcą. Inkubować płytkę z prążkami w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc (16 h).
nuta: W protokole tym wykorzystano szczep ALC2906 SH1000. Szczep ten zawiera plazmid wahadłowy pSK236 z promotorami białka wiążącego penicylinę 2 połączonymi z kasetą reporterową luxABCDE z Photohabdus luminescens.
- Przygotuj tryptyczny bulion sojowy (TSB), mieszając 0,03 g proszku TSB na ml czystej wody i autoklaw TSB w celu sterylizacji. Po schłodzeniu dodaj wszelkie niezbędne antybiotyki przy użyciu sterylnej techniki. W tym protokole dodaj 10 μg/ml chloramfenikolu do TSB, aby wybrać do ekspresji plazmid wahadłowy pSK236, który zawiera kasetę bioluminescencji luxABCDE.
- Wybierz 3-4 oddzielne kolonie z płytki S. aureus do TSB z 10 μg/ml chloramfenikolu, aby rozpocząć hodowlę przez noc. Inkubować bakterie na wytrząsarce inkubacyjnej w temperaturze 37 °C przez noc (16 godzin).
- Rozpocznij nową hodowlę bakteryjną od hodowli nocnej, rozcieńczając próbkę w stosunku 1:50 do TSB za pomocą 10 μg/ml chloramfenikolu. Hodowla w wytrząsarce inkubacyjnej przy prędkości obrotowej 200 obr./min i temperaturze 37 °C.
- Dwie godziny po rozszczepieniu S. aureus monitorować gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na spektrofotometrze. Obserwuj OD600 w funkcji czasu, aby znaleźć wzrost w środkowej fazie logarytmicznej. Dla szczepu ALC2906 SH1000 OD600 wynoszący 0,5 jest średnio logarytmiczny i odpowiada stężeniu 1 x 108 CFU/ml (rysunek 1).
- Gdy OD600 wynosi 0,5, umyj bakterie 1:1 lodowatym DPBS. Odwirować bakterie przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i dodać dodatkowo schłodzony DPBS i dokładnie wymieszać. Odwirować ponownie przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie zdekantować supernatant. Zawiesić osad bakteryjny w żądanym stężeniu. W tych badaniach należy pobrać 3 ml ALC2906 SH1000 i ponownie zawiesić w 1,5 ml PBS, co odpowiada stężeniu bakterii około 2 x 108 CFU/ml. Trzymaj bakterie na lodzie do czasu użycia.
- Aby sprawdzić stężenie bakterii, rozcieńczyć 100 μl próbki bakteryjnej 1:10 000 i 1:100 000 w PBS. Umieścić 20 μl porcji na płytce agarowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 16 godzin. Policz jtk przez badanie ogólne i oblicz stężenie bakterii następnego dnia.
3. Wycinanie skóry i inokulacja S. aureus
- Podaj 100 μl 0,03 mg/ml chlorowodorku buprenorfiny (~0,2 mg/kg) każdej myszy we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
- Dwadzieścia minut po wstrzyknięciu umieść 2-4 myszy w komorze z 2-3 l/min tlenu z 2-4% izofluranem. Gdy myszy zostaną w pełni znieczulone, przenieś myszy pojedynczo do stożka nosowego podłączonego do 2-3 l/min tlenu z 2-4% izofluranem. Sprawdź, czy myszy są w pełni znieczulone, mocno ściskając każdą tylną łapę między kciukiem a palcem wskazującym. Przejdź do następnego kroku, jeśli zwierzę nie reaguje na szczypanie.
- Ogol sekcję o wymiarach 1 cal na 2 cale z tyłu myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i oczyść obszar ze ścinków futra za pomocą czystej ściereczki lub gazy. Unikaj stosowania balsamu do depilacji, ponieważ może on powodować nadmierny stan zapalny.
- Wyczyść tył myszy najpierw 10% gazą nasączoną jodonem powidonem, a następnie 70% gazą nasączoną etanolem. Oczyść obszar spiralnie, przesuwając się na zewnątrz od środka pola operacyjnego. Przed zabiegiem odczekaj około 1 minutę, aż obszar operacyjny wyschnie.
- Przytrzymaj ogolony grzbiet myszy luźno między dwoma palcami i mocno dociśnij sterylną biopsję dziurkowaną 6 mm na środku przygotowanego obszaru operacyjnego. Nie naciągaj skóry.
- Przekręć biopsję stempla, aby utworzyć okrągły kontur na skórze, który całkowicie przecina skórę w co najmniej jednej części konturu. Uważaj, aby nie przeciąć leżącej pod spodem powięzi lub tkanki.
- Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć naskórek i skórę właściwą, postępując zgodnie z okrągłym wzorem odciśniętym przez biopsję stempla.
4. Szczepienie S. aureus
- Napełnij strzykawkę insulinową 28 G żądanym bioluminescencyjnym inokulantem bakteryjnym. W tym badaniu należy podać stężenie 1 x 108 jtk/ml (50 μl). Nie należy podawać więcej niż 100 μl objętości.
- Wstrzyknąć 50 μl inokulantu między powięź a tkankę w środku rany z tyłu myszy. Upewnij się, że inokulant tworzy pęcherzyk w środku rany z minimalnym wyciekiem lub dyspersją.
- Pociągnij skórę właściwą na bok, trzymaj strzykawkę prawie równolegle do tkanki i powoli wciskaj strzykawkę w tkankę, aż poczujesz nagły spadek oporu, co wskazuje na przekłucie powięzi. Ostrożnie wprowadzić strzykawkę do środka rany i powoli dozować inokulant. Powoli wyjąć strzykawkę ze zwierzęcia.
- Wstrzyknąć taką samą objętość sterylnego PBS w rany niezakażonych zwierząt, jak opisano powyżej.
- Umieść zwierzę z powrotem w klatce. Umieść klatkę pod lampą grzewczą lub na poduszce grzewczej i monitoruj zwierzę aż do wyzdrowienia ze znieczulenia.
5. In Vivo BLI i FLI
- Zainicjuj cały program do obrazowania zwierząt za pomocą oprogramowania instrumentu. Znieczulenie myszy w komorze otrzymującej 2-3 LPM tlenu z 2-4% izofluranem. Dostarczyć znieczulenie do stożków wewnątrz wywoływarki.
- Umieść zranioną i zainfekowaną mysz w kamerze. Ustaw mysz tak, aby rana była jak najbardziej płaska. Użyj następującej konfiguracji sekwencji, aby zobrazować myszy.
- Wybierz Luminescencja i Fotografia jako tryb obrazowania. Czas naświetlania wynosi 1 minutę przy małym binningu i F/stop 1 (luminescencja) i F/stop 8 (zdjęcie). Filtr emisji jest otwarty. Kliknij przycisk Acquire, aby nagrać obraz.
- Wybierz Fluorescencja i Fotografia jako tryb obrazowania. Czas naświetlania wynosi 1 s przy małym binningu i F/stop 1 (fluorescencja) i F/stop 8 (zdjęcie) przy długości fali wzbudzenia 465/30 nm i długości fali emisji 520/20 nm przy dużym natężeniu lampy. Kliknij przycisk Acquire, aby nagrać obraz.
- Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj je aż do wyzdrowienia ze znieczulenia.
- Obrazuj myszy codziennie, jak opisano powyżej.
6. Analiza obrazu
- Otwórz obrazy do określenia ilościowego.
- Umieść duży okrągły obszar zainteresowania (ROI) na całym obszarze rany, w tym na otaczającej skórze, dla każdej myszy na obrazie. Sygnały in vivo FLI EGFP i in vivo BLI S. aureus sygnały in vivo wykraczają poza krawędź rany po kilku dniach i zostały uwzględnione w tych badaniach (ryc. 2A i 2B). Kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji i zarejestruj wartości średniego strumienia dla każdej myszy. Wykreśl średni strumień każdego sygnału (p/s) w funkcji czasu.
- Jeśli pożądana jest bezwzględna liczba neutrofili lub S. aureus w ranie, wykonaj następujące eksperymenty.
- Aby skorelować liczbę neutrofili z sygnałami FLI EGFP in vivo, należy zranić myszy C57BL / 6J, jak opisano powyżej, i przenieść szereg neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego (5 x 105 do 1 x 107) od dawców LysM-EGFP lub LysM-EGFPxMyD88-/- bezpośrednio na różne rany. Obraz jak opisano powyżej i skorelować sygnały in vivo FLI EGFP ze znaną ilością neutrofili.
- Aby skorelować S. aureus CFU z sygnałami BLI in vivo, należy zranić i zainfekować myszy, jak opisano powyżej. W pierwszym dniu po zakażeniu zarejestruj in vivo sygnały BLI od myszy i natychmiast poddaj je eutanazji i schłodzeniu. Wyciąć ranę, homogenizować tkankę i rozcieńczyć bakterie na agarze do inkubacji przez noc. Następnego dnia policz kolonie, aby określić CFU na ranę.
- Aby zmierzyć gojenie się rany, dopasuj okrągły zwrot z inwestycji na krawędzi rany i zmierz obszar rany (cm2) i wykreśl ułamkową zmianę w stosunku do wartości wyjściowej w funkcji czasu (Rysunek 2C).
