$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Indukcja mysiego zapalenia powierzchni oka
- Wykonaj przygotowanie immunogenowe do immunizacji.
- Przygotować immunogen świeżo w dniu immunizacji, mieszając albuminę jaja kurzego (OVA, 50 mg/ml) i toksynę krztuścową (100 μg/ml) w soli fizjologicznej i adiuwantowym wodorotlenku glinu (40 mg/ml) (patrz tabela materiałów) w proporcji 1:1.
ostrożność: Wykonać otwieranie, rozpuszczenie i przygotowanie immunogenowe toksyny krztuścowej w laminarnej komorze bezpieczeństwa. Nosić odzież ochronną i unikać kontaktu ze skórą.
- Mieszaninę immunogenu i adiuwantu inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i załadować 100 μl do strzykawki o pojemności 1 ml.
- Wykonaj dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu immunogenu u myszy nieznieczulonej.
- Chwyć miękko mysz za ogon, chwytając siatkę klatki. Przytrzymaj mocno skórę pleców i szyi między kciukiem a palcem wskazującym, a ogon i kończyny dolne między palcem serdecznym a małym przymocuj do dłoni.
- Trzymaj nieruchomą mysz głową w dół.
- Wstrzyknąć 100 μl przygotowanego roztworu immunogenowego w prawy lub lewy kwadrant dolnej części jamy brzusznej.
- Wykonać prowokację powierzchni oka 2 tygodnie po szczepieniu.
- Znieczulić mysz izofluranem (2,5%).
- Nałóż 5 μl OVA (50 mg/ml) lub soli fizjologicznej (0,9% NaCl) na oko na oba oczy i poczekaj, aż kropla zostanie wchłonięta przez oko. Trwa to ~5 min.
- Powtarzaj procedurę 1x dziennie przez 7 dni.
nuta: W ten sam sposób można zastosować miejscowe podawanie leków.
2. Zbiór wysięków z oczu
- Odzyskaj wysięki z oczu powstałe podczas fazy prowokacji, nakładając 50 μl sterylnego soli fizjologicznej na oko natychmiast po prowokacji.
3. Wycięcie tkanek powierzchni oka
- Dokładnie rozetnij powieki i gałkę oczną, wykonując poniższe czynności.
- Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy.
- Umieść mysz na równej powierzchni.
- Zdezynfekuj okolice oczodołu za pomocą wacika nasączonego 70% etanolem.
- Wykonaj nacięcie między uchem a zatoką zadoczodołową i wzdłuż powierzchni powyżej kości płaskonabłonkowej pionowo, przedłużając nacięcie poziomo poniżej dolnej powieki wzdłuż kości szczęki i powyżej górnej powieki wzdłuż kości czołowej. W ten sposób powstaje nacięcie wokół oka (ryc. 1).
- Ostrożnie przytrzymaj wypreparowaną tkankę wokół oka za pomocą zakrzywionych kleszczy i wyciągnij tkankę i gałkę oczną.
- Umieścić wycięte narządy w sterylnym PBS.
- Przyciąć nadmiar tkanki mięśniowej twarzy wokół wyciętych górnych powiek za pomocą skalpela i pod mikroskopem stereoskopowym.
- Zbierz spojówkę, wykonując poniższe czynności.
- Umieść górną powiekę na suchej szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.
- Za pomocą cienkiej pęsety i skalpela bardzo delikatnie oderwij białawo-śluzową warstwę z wewnętrznej powierzchni powieki.
- Następnie wypreparuj rogówkę, wykonując poniższe czynności.
- Umieść gałkę oczną na nowej suchej szalce Petriego na wierzchu suchego lodu na 3 minuty.
- Umieść szalkę Petriego na powierzchni ławki w stabilnej pozycji.
- Wykonaj małe nacięcie na granicy rogówki obok rąbka za pomocą cienkich, ostrych nożyczek.
- Przedłuż nacięcie skalpelem wokół gałki ocznej, oddzielając twardówkę od rogówki.
- Usuń resztki tęczówki i soczewki z tylnej strony rogówki, obficie spłukując roztworem soli fizjologicznej.
