$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pozyskiwanie i aktywacja makrofagów szpiku kostnego za pomocą przeciwciał
- Przeprowadzić eutanazję za pomocą uduszenia CO2 .
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Poddaj mysz eutanazji 5% znieczuleniem izofluranem przez 60 - 90 sekund, aż do unieruchomienia, a oddech będzie głęboki i powolny.
- Wyłącz znieczulenie izofluranem i podawaj 6 - 8 l/min CO2 do momentu, aż mysz przestanie oddychać. Pozostaw mysz z włączonym CO2 na co najmniej kolejne 5 minut. Sprawdź, czy nie słychać już bicia serca ani oddechu. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
UWAGA: Myszy w wieku 8 - 12 tygodni zapewniają najwyższą wydajność makrofagów.
- Spryskaj nogi myszy 70% etanolem i przypnij je rękami i nogami rozciągniętymi w pozycji leżącej nad piankową deską. Za pomocą nożyczek i kleszczy, aby przytrzymać skórę, wykonaj płytkie cięcie (0,2 cm), aby usunąć skórę i sierść z powierzchni każdej z tylnych nóg.
nuta: Wykonaj tę procedurę i wszystkie manipulacje kulturą tkankową w sterylnym kapturze.
- Przytnij mięśnie, aby uwidocznić piszczele i kości udowe. Usuń piszczele i kości udowe, przecinając kość i mięśnie tuż poniżej stawu biodrowego i powyżej kostek. Odetnij jak najwięcej mięśni
.
- Spryskaj kości 70% etanolem i odczekaj 1 minutę, aż odparuje, a następnie umieść je w 6-dołkowej płytce z podłożem do płukania kości (zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS)).
- Przytnij końce kości, odcinając 0,1 cm kości od kostki i górnej części kości udowej, tak aby jama kostna była odsłonięta. Upewnij się, że szpik jest widoczny, a w jamie kostnej można umieścić igłę o rozmiarze 26G.
- Przetnij kości i mięśnie, aby oddzielić piszczele i kości udowe od stawów kolanowych. Wprowadzić do jamy igłę o rozmiarze 26 dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml. Przepłukać szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki do płukania kości. Przepłukać dwie piszczele i dwie kości udowe z jednej myszy do każdej probówki o pojemności 50 ml.
- Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół lub obracaj szpik z małą prędkością, aby delikatnie rozproszyć grudki. Sznurki szpiku powinny być rozdrobnione na małe (mniej niż 0,5 mm) drobinki szpiku. Napełnij stożkową probówkę do 50 ml pożywką do płukania kości. Zawartość stożkowej probówki odpipetować do kolby o długości 75cm2 poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 h.
nuta: Dojrzałe makrofagi i komórki mezenchymalne przylegną do kolby i zostaną wyrzucone, podczas gdy pożądane hematopoetyczne komórki progenitorowe pozostaną w zawiesinie.
- Odpipetować pożywkę z krwionośnymi komórkami progenitorycznymi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki hodowlanej czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/ml MCSF, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 150 μM monotioglicerolu (MTG)).
- Policz komórki za pomocą hemocytometru. Dodać pożywkę do ponownego zawieszenia komórek do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml, 1,5 x 107 komórek/kolbę w 30 ml pożywki i delikatnie pipetować w górę iw dół. Odpipetować 30 ml zawiesiny do nowej kolby o długości 75cm2 poddanej kulturom tkankowym.
- W 4. i 7. dniu po początkowej hodowli w kroku 1.9 sprawdź, czy komórki przylegają do siebie i są lekko rozgałęzione, używając mikroskopu jasnego pola z odwróconym kontrastem fazowym. Wyrzucić pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki. Umyj komórki jednorazowo IMDM i dodaj 30 ml pożywki hodowlanej MCSF.
- Gdy komórki osiągną dojrzałość do 10 dnia (>95% dodatnie dla F4/80 i Mac-1), sprawdź ponownie, czy komórki przylegają i nieznacznie.
- Aby ułożyć komórki na płytki do stymulacji, wyjmij pożywkę hodowlaną z kolby i dodaj 8 ml bezenzymatycznego buforu dysocjacyjnego komórek na bazie EDTA (tabela materiałów). Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Zeskrobać komórki delikatnie, z niewielkim naciskiem, za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki oderwały się od powierzchni kolby. Pipetą zdysocjowano komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę 3 razy 5 ml IMDM i połączyć roztwór płuczący z zebranymi komórkami. Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki hodowlanej MCSF na 50 ml stożkowej probówki. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i umieścić na płytce 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105 komórek/basenik) na dołek 96-dołkowej płytki z płaskim dnem poddanej działaniu hodowli tkankowej.
nuta: Kości z jednej myszy wygenerują wystarczającą ilość komórek na 100 dołków. W razie potrzeby 1 ml komórek można posiać na płytce 6-dołkowej (hodowla tkankowa poddana obróbce, płaskie dno). Większa liczba komórek (1 x 10,6 komórek) może być przydatna do analiz western blot.
- Po przyleganiu stymuluj zduplikowane lub trzykrotne studzienki, z których każda zawiera 10 ng / ml LPS w IMDM, 30 mg / ml IVIg lub IVIg + LPS. Dawki LPS lub IVIg można miareczkować w celu optymalizacji odpowiedzi. Pozostaw zduplikowane lub potrojone studzienki jako niestymulowane kontrole. Inkubować je przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
nuta: Ponownie posiane komórki powinny przylegać do dołków hodowli tkankowych w ciągu 1 godziny.
- Zebrać supernatanty komórkowe z każdej studzienki do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml i usunąć wszelkie cząstki stałe, wirując z prędkością 10 000 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant komórek i unikać naruszania osadu. Umieścić sklarowany supernatant komórkowy w sterylnej probówce do mikrowirówki.
nuta: Supernatanty komórkowe można natychmiast oznaczyć na obecność cytokin IL-10 i podjednostki cytokin IL-12/23p40 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas. Postępuj zgodnie z protokołem ELISA z dostępnego na rynku zestawu (tabela materiałów). Można oznaczyć inne cytokiny prozapalne, takie jak IL-6 i TNF, ponieważ są one również redukowane przez jednoczesne leczenie stymulacją IVIg + LPS w porównaniu ze stymulacją samym LPS. Po stymulacji przylegające komórki mogą być przygotowane do technik takich jak western blotting lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (Q-PCR).