Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wyzwanie dla myszy in vivo za pomocą dożylnej immunoglobuliny i lipopolisacharydu (IVIg+LPS) oraz pobieranie makrofagów otrzewnowych
- Zważ każdą mysz. Obliczyć objętość dożylnego ig (100 mg/ml stężenia podstawowego) potrzebną do podania końcowej dawki 2,5 g/kg masy ciała. Obliczyć ilość LPS (100 μg/ml stężenia podstawowego w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco (IMDM)) firmy Iscove potrzebna do zapewnienia końcowej dawki 0,2 μg/g masy ciała.
nuta: Na przykład dla myszy o wadze 20 g wymagane jest 500 μl roztworu podstawowego IVIg i 40 μl roztworu LPS o stężeniu 100 μg/ml.
- Pobrać wymaganą ilość IVIg i LPS do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w sterylną igłę o rozmiarze 26. W przypadku myszy kontrolnych, które nie otrzymają IVIg, zastąp równoważną objętość IVIg sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o pH 7,4.
- Chrap mysz jedną ręką, chwytając jej skórę z tyłu szyi kciukiem i palcem wskazującym, a przytrzymując ogon i tylne nogi pozostałymi palcami. Przechyl jego ciało w kierunku ziemi.
- Umieść igłę pod kątem 30 - 40° w stosunku do brzucha myszy, w prawym dolnym kwadrancie, skos do góry i włóż 1,5 cm. Wstrzyknij IVIg + LPS lub PBS + LPS dootrzewnowo.
- Po 1 godzinie należy przeprowadzić eutanazję z użyciem uduszenia dwutlenkiem węgla (CO2 ).
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Poddaj mysz eutanazji 5% znieczuleniem izofluranem przez 60 - 90 sekund, aż do unieruchomienia, a oddech będzie głęboki i powolny.
- Wyłącz znieczulenie izofluranem i podawaj 6-8 l/min CO2 do momentu, aż mysz przestanie oddychać. Pozostaw mysz z włączonym CO2 na co najmniej kolejne 5 minut. Sprawdź, czy nie słychać już bicia serca ani oddechu. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
UWAGA: Myszy w wieku 8 - 12 tygodni zapewniają najwyższą wydajność makrofagów.
- Przypnij mysz do piankowej tablicy z rozłożonymi kończynami. Spryskaj części 70% etanolem.
nuta: Zabieg należy wykonać w sterylnym kapturze.
- Wykonaj płytkie nacięcie w skórze (0,2 cm) nożyczkami wzdłuż linii środkowej myszy, aby uniknąć przecięcia jamy otrzewnej. Ściągnij skórę brzucha z brzucha myszy za pomocą kleszczy, tak aby widoczna była wyściółka nienaruszonej ściany otrzewnej.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml 5 ml sterylnego PBS (pH 7,4). Włóż igłę o rozmiarze 25 lub 27 w górnej części wnęki z lewej lub prawej strony w kierunku środka myszy z ukosem igły do góry.
nuta: Ostrożnie umieścić igłę w myszy, aby nie wstrzykiwać PBS do narządów, ale raczej do przestrzeni otrzewnej.
- Wepchnij płyn do jamy otrzewnej. Wyciągnij igłę z jamy i masuj otrzewną przez 10 sekund, aby usunąć wszelkie komórki. Wbić igłę w górną część jamy i omijać narządy. Zebrać i umieścić odzyskany płyn popłuczyn w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
nuta: Na każde 5 ml wstrzykniętego płynu zostanie odzyskane około 3,75 ml.
- Powtórz wstrzyknięcie i odzyskaj (kroki 1,8 - 1,9) jeszcze 3 razy (całkowita objętość wstrzyknięcia 20 ml), aby odzyskać łącznie 15 ml płynu do płukania. Zebrać płukanie z każdej myszy do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: Po ostatnim wstrzyknięciu może być łatwiej pobrać płyn z lewej i prawej strony myszy, gdzie nagromadził się płyn. Narządy będą powodować mniejsze zakłócenia z igłą w tej pozycji.
- Wirować komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć 1 ml odzyskanego płynu z płukania i użyć do analiz interleukiny lub IL-10 i IL-12/23p40 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta lub zamrozić w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz.
nuta: Aby zapewnić dokładne porównanie między zabiegami analizy cytokin płynu popłuczynowego, należy wykonać 4-krotne płukanie jamy otrzewnej w dawce 5 ml do uzyskania końcowej objętości 15 ml. Nie wszystkie płyny zostaną odzyskane z każdego spłukiwania.
- Ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki galwacyjnej (IMDM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny) na przepłukaną mysz. Policz żywotne makrofagi.
nuta: Makrofagi będą nieco większe niż inne komórki otrzewnej. Typowa wydajność to 5 x 105 - 1 x 106 makrofagów/mysz przy użyciu myszy C57BL/6 typu dzikiego.
fakultatywny: Jeśli w osadzie komórkowym znajduje się duża liczba czerwonych krwinek, należy przeprowadzić etap lizy zgodnie z instrukcjami producenta w celu ich usunięcia.
- Zawiesić komórki w pożywce galwanowej w stężeniach 1 x 106 makrofagów/ml i rozlać 100 μl na dołek na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu płaskiej hodowli tkankowej.
nuta: Do eksperymentu może być konieczne zebranie komórek z więcej niż jednej myszy. Na przykład, jeśli jedna mysz miała 5 x 105 makrofagów, wymagane byłoby 500 μl pożywki galwanicznej.
- Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić makrofagom przyleganie. Komórkami przylegającymi są makrofagi otrzewnej. Usuń supernatanty komórkowe i komórki nieprzylegające. Przepłukać studzienki dwukrotnie 200 μl IMDM (wstępnie podgrzanym do 37 °C), odczekać 10 s i powoli przechylić płytkę. Wymień medium galwaniczne. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut przed stymulacją.
- Po przyleganiu stymuluj zduplikowane lub potrójne studzienki, z których każda zawiera 10 ng / ml LPS w IMDM, 30 mg / ml IVIg lub IVIg + LPS. Dawki LPS lub IVIg można miareczkować w celu optymalizacji odpowiedzi. Pozostaw zduplikowane lub potrojone studzienki jako niestymulowane kontrole. Inkubować je przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
nuta: Ponownie posiane komórki powinny przylegać do dołków hodowli tkankowych w ciągu 1 godziny. Próbki mogą być użyte natychmiast lub zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C do analizy cytokin metodą ELISA.
- Zebrać supernatanty komórkowe z każdej studzienki do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml i usunąć wszelkie cząstki stałe, wirując z prędkością 10 000 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant komórek i unikać naruszania osadu. Umieścić sklarowany supernatant komórkowy w sterylnej probówce do mikrowirówki.
nuta: Supernatanty komórkowe mogą być oznaczane na obecność cytokin, IL-10 i podjednostki cytokin, IL-12/23p40, za pomocą testu ELISA natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C przez długi czas. Postępuj zgodnie z protokołem ELISA z dostępnego na rynku zestawu (Tabela materiałów). Można oznaczyć inne cytokiny prozapalne, takie jak IL-6 i czynnik martwicy nowotworu (TNF), ponieważ są one również redukowane przez jednoczesne leczenie stymulacją IVIg + LPS w porównaniu ze stymulacją samym LPS. Po stymulacji przylegające komórki mogą być przygotowane do technik takich jak western blotting lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (Q-PCR).
