Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Uodpornienie myszy
- Przygotować główną mieszankę szczepionek w sterylnym buforze fizjologicznym, takim jak sól fizjologiczna lub DPS.
nuta: Całkowita objętość w mieszance powinna być o 10% większa niż wymagana do uodpornienia całej grupy. Stężenia w składzie szczepionki są szczegółowo opisane poniżej w krokach 1.1.1 i 1.1.2. Przetransportuj przedmioty do wiwarium na lodzie.
- W przypadku badań nad B. plztuścem należy uwzględnić następujące grupy szczepionek: bezkomórkową szczepionkę przeciwko krztuścowi (aPV) i czynnik kolonizacji aPV + Bordetella A (BcfA). Ponadto należy stosować ałun, same antygeny szczepionkowe (hemaglutyninę nitkowatą (FHA) i pertaktynę (Prn)) oraz myszy wcześniej (nieuodpornione) jako grupy kontrolne.
UWAGA: aPV to 1/5 dawki ludzkiej zatwierdzonego przez FDA aPV, który składa się z toksoidu tężcowego, zredukowanego toksoidu błoniczego, toksoidu krztuścowego (PT), hemaglutyniny nitkowatej (FHA) i pertaktyny (Prn) zaadsorbowanej na solach glinu. Jedna dawka ludzkiego obecnego krztuśca aPV wynosi 0,5 ml, dlatego 1/5 dawki wynosi 0,1 ml. Objętości aPV + BcfA wynoszą 0,1 ml aPV (1/5 dawki ludzkiej) + 0,046 ml BcfA (30 μg) na mysz. Maksymalna objętość, która może być bezpiecznie dostarczona do jednego mięśnia, wynosi 0,1 ml. Ponieważ objętość szczepionki aPV + BcfA jest większa niż 0,1 ml, szczepionka musi być podawana do obu ramion, podzielonych mniej więcej po równo, aby mogła być bezpiecznie podawana.
- Aby przygotować szczepionkę eksperymentalną, dla jednej dawki należy połączyć 1 μg FHA i 0,5 μg Prn z 50 μg żelu wodorotlenku glinu w sterylnym PBS. Pozostawić eksperymentalny aPV do mieszania na walcu laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie wirować probówkę o masie 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić zawartość w 1 ml sterylnego PBS.
- W wiwarium ustaw aparat do znieczulania (ryc. 1).
nuta: Przed użyciem upewnij się, że w odpowiednich zbiornikach jest odpowiedni poziom tlenu i izofluranu. Zważ pojemnik z izofluranem i wymień go, gdy jego waga wzrośnie o 50 g.
- Dokładnie wyczyść szafę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i umieść czystą komorę indukcyjną wewnątrz BSC. Podłącz przewody anestezjologiczne i zmiatające z aparatu anestezjologicznego do komory indukcyjnej. Otwórz zbiornik tlenu za pomocą regulatora, aby upewnić się, że tlen przepływa i ustaw poziom na 1,5-2 l/min.
- Umieść myszy w pożądanym wieku (6-12 tygodni) w komorze indukcyjnej. Włącz izofluran do 2,5-3%, aby lekko znieczulić myszy. Monitoruj zwierzęta do momentu, gdy przestaną się poruszać w komorze, a ich oddech zwolni.
- Przetestuj poziom indukcji, ściskając palce u stóp, obserwując, czy nie ma odruchowych ruchów. Jeśli go nie ma, myszy są gotowe do wstrzyknięcia.
UWAGA: W tym eksperymencie cała klatka zwierząt została znieczulona za jednym razem. Można zdecydować się na znieczulenie zwierząt indywidualnie do wstrzyknięcia lub wstrzyknięcie zwierząt bez znieczulenia. Każda z tych metod jest odpowiednia.
- W międzyczasie należy przygotować strzykawki insulinowe o pojemności 1 ml (28G1/2) z 0,1 ml szczepionki każda. Gdy zwierzęta są już w pełni indukowane, wyjmij jedno zwierzę z komory i połóż mysz brzusznie na ręczniku lub podkładce na ławkę.
- Szczepionkę należy podawać domięśniowo. Trzymając strzykawkę pod kątem 45° i skosem skierowanym do góry, wprowadzić strzykawkę ~5 mm do mięśnia naramiennego myszy i wstrzyknąć szczepionkę.
nuta: Tylna ćwiartka/bok może być używana jako miejsce wstrzyknięcia zamiast naramiennego.
- Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę wbitą w mięsień przez ~5-10 s. Po dostarczeniu objętości należy obrócić strzykawkę o 180° tak, aby skos był skierowany na zewnątrz, aby utworzyć uszczelnienie i zapobiec wyciekowi szczepionki. Następnie należy powoli wyciągnąć igłę z miejsca wstrzyknięcia.
- Umieść mysz z powrotem w klatce. Powtórz procedurę ze wszystkimi zwierzętami w wyznaczonej grupie.
- Wyłącz izofluran i przepłucz komorę indukcyjną tlenem przed znieczuleniem następnej klatki myszy.
- Monitoruj zwierzęta, dopóki wszystkie nie będą czujne i nie poruszają się w klatce. Umieść klatkę z powrotem w miejscu obudowy.
- Monitoruj zwierzęta co 12 godzin po szczepieniu, do 48 godzin, pod kątem klinicznych objawów chorobowości, takich jak szorstka/zaniedbana sierść, powolny chód lub utrudniony oddech. Jeśli objawy utrzymują się, skonsultuj się z weterynarzem instytucjonalnym i w razie potrzeby usuń myszy z badania.
- Cztery tygodnie po początkowym szczepieniu wzmocnij myszy, znieczulając i podając zastrzyki domięśniowe do prawego mięśnia naramiennego myszy za pomocą tego samego preparatu szczepionki, który był wcześniej podawany.
- Ponownie monitoruj zwierzę pod kątem jakichkolwiek objawów klinicznych. Zwierzęta domowe przez dodatkowe 2 tygodnie, a następnie kontynuuj infekcję.
2. Mysi model infekcji donosowej
- W wiwarium ustaw warunki tlenu i znieczulenia zgodnie z opisem w krokach 1.3 i 1.4. Jak opisano w kroku 1.5, umieść myszy w komorze w celu znieczulenia. Monitoruj zwierzęta, aż zacznie działać znieczulenie.
- Kiedy myszy są znieczulane, wyjmuj jedno zwierzę na raz z komory indukcyjnej. Podnieś mysz za kark grzbietowej klatki piersiowej, za łopatkami i szyją. Ustaw mysz pionowo, aby uzyskać dostęp do nosa.
- Używając końcówki pipety o pojemności 200 μl, powoli nałóż 40-50 μl inokulum bakteryjnego B. pertussis na nozdrzyska myszy (20-25 μl w każdym nozdrzu). Przytrzymaj mysz, aż całe inokulum zostanie wdychane przez zwierzę. Jeśli część inokulum wydostanie się na zewnątrz, zbierz bąbelki i ponownie wlej je do nozdrzy. Dostarczyć równą ilość sterylnego PBS jednej grupie myszy jako kontrolę ujemną.
- Tak jak w krokach 1.10-1.12, należy umieścić zaszczepione zwierzęta z powrotem w klatce i monitorować je, dopóki nie staną się czujne i nie będą się poruszać. Przywróć klatkę z powrotem do pierwotnej przestrzeni obudowy na stojaku. Przepłukać komorę indukcyjną tlenem, aby usunąć pozostałości izofluranu przed znieczuleniem następnej grupy zwierząt. Monitoruj zwierzęta przez 48 godzin po zakażeniu.
- W laboratorium seryjne rozcieńczenia inokulum na płytkach w sterylnym PBS, w celu sprawdzenia rzeczywistych jednostek tworzących kolonie (CFU) dostarczonych myszom. Płytka 0,1 ml rozcieńczeń na 10% płytkach BG + Sm (płytki agarowe Bordet-Gengou uzupełnione 10% zdefibrynowaną krwią owczą i 100 μg/ml streptomycyny) (Figura 2A). Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i rosnąć przez 4 dni. Policz i oblicz jtkowie z inokulum dostarczonego myszy (ryc. 2B).
3. Pobieranie tkanek zwierzęcych po zakażeniu
- Przygotuj się do sekcji myszy i pobrania tkanek.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia (nożyczki grube i cienkie, nożyczki zakrzywione, drobne kleszcze, tłuczki do granulek i rozsiewacze trójkątne) potrzebne do przetwarzania tkanek w autoklawie. Zamknij narzędzia w woreczkach do sterylizacji. Zawiń homogenizatory szklane, zanurz je w folii i dodaj taśmę autoklawową, aby wskazać sterylność.
- Przygotuj płytki agarowe na 1 lub 2 dni przed pobraniem tkanek, aby upewnić się, że płytki zestalają się przed użyciem. W przypadku B. pertussis należy użyć 10% BG + Sm. Tabliczki znamionowe do płuc dla każdej myszy z pożądanymi rozcieńczeniami, określonymi empirycznie dla każdego eksperymentu.
- Napełnij i oznacz probówki do rozcieńczania CFU. Dodaj 0,9 ml sterylnego PBS do sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w oparciu o liczbę narządów do przetworzenia i rozcieńczenia na narząd.
- Napełnianie i etykietowanie probówek do pobierania tkanek:
- Płuca: dodać 2 ml sterylnej 1% kazeiny z PBS do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby pobrać płuca do badania histologicznego, dodaj 2 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) i przechowuj ją w temperaturze pokojowej.
- Świeży 70% etanol powinien być przygotowany do napełniania zlewek i butelek z rozpylaczem do sekcji.
- Wszystkie materiały do wiwarium należy przewieźć na wózku w dniu zbiorów. Wyczyść BSC i ustaw aparat do znieczulania jak w krokach 1.3 i 1.4.
- Umieść myszy przeznaczone do sekcji w komorze indukcyjnej i przy przepływie tlenu włącz izofluran do 5% i poczekaj, aż zwierzęta stracą przytomność. Usuwaj myszy pojedynczo i zwichnij zwierzę szyjką macicy jako drugorzędną metodę, aby zapewnić śmierć. Po zwichnięciu szyjki macicy eutanazja powinna być potwierdzona brakiem częstości oddechów i/lub brakiem odruchu wycofania (test szczypania palca).
- Umieść mysz brzuszną stroną skierowaną do góry na desce preparacyjnej i otwórz ręce i nogi. Spryskaj korpus myszy 70% etanolem.
- Za pomocą kleszczy zaciśnij skórę poniżej brzucha, na środku miednicy. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj pionowe cięcie aż do żuchwy. Następnie odetnij skórę od ściany otrzewnej, rozsuwając dwie warstwy, wykonując małe ruchy z zamkniętymi nożyczkami. Ułóż skórę na bokach tuszy, aby stworzyć niezakłócone pole do sterylnego pobierania narządów.
- Użyj kleszczy, aby ustabilizować klatkę piersiową w wyrostku mieczykowatym i rozciąć przeponę. Płuca powinny opróżnić się i opaść w kierunku kręgosłupa. Rozetnij klatkę piersiową po bokach, aby zdjąć napierśnik.
- Wyizoluj i usuń górny płat prawego płuca, przecinając tętnice płucne i żyły. Umieść płatek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10% NBF i umieść probówkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 24 godziny, aby utrwalić tkankę. Odizoluj pozostałe płaty prawego płuca i lewego płuca. Umieść płatki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml 1% kazeiny w PBS i umieść ją na lodzie.
- Wyrzuć tuszę do worka na zagrożenie biologiczne. Przed sekcją następnego zwierzęcia opłucz narzędzia wodą dejonizowaną, a następnie umieść je w zlewce wypełnionej 70% etanolem. Wyjmij narzędzia, strząśnij nadmiar etanolu, a następnie przystąp do następnego rozbioru.
- Przeanalizuj każdą mysz, wykonując czynności wymienione powyżej.
- Przetwarzaj tkanki zgodnie z poniższym opisem.
4. Przetwarzanie płuc
- Przenieś płuca (w 2 ml 1% kazeiny w PBS) do sterylnego homogenizatora o pojemności 15 ml Dounce. Użyj tłuczka do homogenizacji tkanki. Dysocjuj, aż nie pozostaną żadne duże cząstki tkanki. Umieścić homogenizowaną zawiesinę z powrotem w oryginalnej probówce o pojemności 15 ml.
- Pobrać 0,3 ml porcji do posiewu CFU i odwirować homogenat o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać i podzielić na porcje supernatant w podwielokrotnościach o objętości 0,5 ml do wstępnie znakowanych probówek do mikrowirówek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy cytokin metodą ELISA.
- Przygotować wybrane rozcieńczenia, seryjnie rozcieńczając 0,1 ml homogenizowanej zawiesiny płucnej w probówkach rozcieńczających (0,9 ml jałowego PBS). Umieść 0,1 ml empirycznie wybranych rozcieńczeń na wstępnie znakowanych płytkach 10% BG + Sm i rozprowadź za pomocą sterylnego trójkątnego rozsiewacza.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym przez 4 dni.
- Policz i oblicz jtk/płuco (ryc. 3). Krótko mówiąc, pomnóż odzyskane liczby CFU przez współczynnik rozcieńczenia płytki, a następnie również przez całkowitą objętość, w której narząd został przetworzony. Obliczenia CFU są następnie przekształcane w wartości Log10 dla każdego zwierzęcia i przedstawiane na wykresie.
- Płytki z 30-300 koloniami można łatwo i dokładnie policzyć. Do obliczeń nie należy używać płytek z mniej niż 6 koloniami, ponieważ tak niska liczba kolonii wprowadza błędy. Aby uzyskać dolną granicę wykrywalności, całkowitą objętość, w której narząd był homogenizowany, dzieli się przez objętość użytą do naznaczenia na płytce z nierozcieńczonego homogenatu (np. 2 ml całkowitej objętości podzielone przez 0,1 ml nierozcieńczonego homogenatu równa się dolnej granicy 20 wykrywalnych jtk
).
