UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu komórek B IIA1.6.
1. Aktywacja limfocytów B za pomocą koralików pokrytych antygenem
- Przygotowanie kulek pokrytych antygenem
- Aby aktywować limfocyty B, użyj kulek NH2 kowalencyjnie pokrytych antygenem (kulki pokryte Ag), które są przygotowywane przy użyciu 50 μL (~20 x 106 kulek) 3 μmNH 2-kulek z antygenami aktywującymi (BCR-ligand+) lub nieaktywującymi (BCR-ligand-).
- W przypadku komórek B IIA1.6 należy użyć fragmentu anty-IgG-F(ab')2 jako BCR-ligand+ i anty-IgM-F(ab')2 lub albuminy surowicy bydlęcej (BSA) jako ligandu BCR-. Aby aktywować pierwotne limfocyty B lub linię komórkową IgM+ B, użyj anty-IgM-F(ab')2 jako BCR-ligand+ i BSA jako BCR-ligand-.
nuta: Aby uniknąć wiązania ligandów z receptorem Fc, należy użyć fragmentów przeciwciała F(ab') lub F(ab')2 zamiast przeciwciał o pełnej długości.
- Aby przystąpić do przygotowania kulek pokrytych Ag, należy umieścić je w probówkach mikrowirówkowych o niskiej wiązalności białka, aby zmaksymalizować odzysk kulek podczas manipulacji próbką. Dodaj 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do płukania kulek i odwirowywać przy 16 000 x g przez 5 minut. Odessać supernatant.
- Ponownie zawiesić kulki w 500 μl 8% aldehydu glutarowego, aby aktywować grupy NH2 i obracać przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
ostrożność: Roztwór podstawowy aldehydu glutarowego powinien być stosowany wyłącznie w dygestoriach chemicznych. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS).
- Odwirować kulki przy 16 000 x g przez 5 minut, usunąć aldehyd glutarowy i umyć kulki jeszcze trzy razy 1 ml 1x PBS.
ostrożność: Roztwór aldehydu glutarowego należy wyrzucić jako niebezpieczne odpady chemiczne.
- Ponownie zawiesić aktywowane kulki w 100 μl 1x PBS. Próbkę można podzielić na dwie probówki mikrowirówkowe o niskim poziomie wiązania białek: 50 μl dla ligandu BCR+ i 50 μl dla ligandu BCR-.
- Do przygotowania roztworu antygenu należy użyć dwóch probówek mikrowirówek o niskiej zawartości wiązania białek o pojemności 2 ml zawierających 100 μg/ml roztworu antygenu w 150 μl PBS: jedną probówkę z BCR-ligand+, a drugą z BCR-ligand-.
- Dodać 50 μl roztworu aktywowanych kulek do każdej probówki zawierającej 150 μl roztworu antygenu, odwirować i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dodać 500 μl 10 mg/ml BSA w celu zablokowania pozostałych reaktywnych grup NH2 na kulkach i obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Odwirować kulki o sile 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyj koraliki zimnym 1x PBS jeszcze trzy razy.
- Ponownie zawiesić aktywowane kulki w 70 μl 1x PBS.
- Aby określić końcowe stężenie kulek pokrytych Ag, rozcieńczyć niewielką objętość kulek w PBS (1:200) i policzyć za pomocą hemocytometru. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
nuta: Koraliki powlekane Ag nie powinny być przechowywane dłużej niż 1 miesiąc.
2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z poli-L-lizyny
- Przed testem aktywacji limfocytów B za pomocą kulek pokrytych Ag należy przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną (szkiełka nakrywkowe PLL). Użyj probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml roztworu PLL o stężeniu 0,01% w/v i zanurz w roztworze szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm. Obracaj przez noc przy RT.
- Umyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS i pozostaw do wyschnięcia na 24-dołkowej pokrywie płytki pokrytej folią parafinową. Kontynuuj aktywację limfocytów B.
3. Aktywacja limfocytów B
- Aby rozpocząć aktywację limfocytów B za pomocą kulek, najpierw rozcieńczyć linię komórek B IIA1.6 do 1,5 x 106 komórek/ml w pożywce CLICK (RPMI-1640 uzupełniony 2 mM L-alanino-L-glutaminą + 55 μM beta-merkaptoetanolu + 1 mM pirogronianu + 100 U/ml penicyliny + 100 μg/ml streptomycyny) + 5% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej [FBS]).
- Połącz 100 μl (150 000 komórek) komórek B IIA1.6 z kulkami pokrytymi Ag w stosunku 1:1 w probówkach o pojemności 0,6 ml. Delikatnie wymieszać za pomocą wiru i nasion na szkiełkach nakrywkowych PLL. Inkubować w różnych punktach czasowych w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C / 5% CO2 ). Typowe punkty czasu aktywacji to 0, 30, 60 i 120 min. Dla czasu 0 umieścić szkiełka nakrywkowe PLL w pokrywie płytki 24-dołkowej na lodzie. Dodać mieszaninę kulek pokrytych komórkami Ag i inkubować przez 5 minut na lodzie.
nuta: Ważne jest, aby mieszać wirowo zamiast pipetowania w górę i w dół, ponieważ może to zmniejszyć liczbę kulek w próbce ze względu na ich gromadzenie się w plastikowej końcówce pipety. Używaj kulek pokrytych ligandem BCR- jako kontroli ujemnej dla każdego testu. Zalecamy aktywację najpierw najdłuższego czasu inkubacji, a następnie kolejnych punktów czasowych. Obliczyć interwały aktywacji dla próbek w taki sposób, aby były one gotowe do utrwalenia w tym samym czasie.
- Dodaj 100 μL zimnego 1x PBS do każdego szkiełka nakrywkowego, aby zatrzymać aktywację i kontynuować protokół immunofluorescencji.
