Aktywacja limfocytów B na szkiełku nakrywkowym pokrytym antygenem

Streszczenie

Źródło: Ibañez-Vega, J., et al., Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas tworzenia synaps immunologicznych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje aktywację limfocytów B in vitro. Proces ten obejmuje interakcję antygenu z receptorami komórek B, prowadzącą do przebudowy cytoszkieletu, tworzenia synaps immunologicznych, ruchu lizosomów, internalizacji antygenu, przetwarzania, a następnie prezentacji na cząsteczkach MHC w celu aktywacji komórek B.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z poli-L-lizyny

1. Przed testem aktywacji limfocytów B za pomocą kulek pokrytych Ag należy przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną (szkiełka nakrywkowe PLL). Użyj probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml roztworu PLL o stężeniu 0,01% w/v i zanurz w roztworze szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm. Obracaj przez noc przy RT.
2. Umyj szkiełka nakrywkowe 1xPBS i pozostaw do wyschnięcia na 24-dołkowej pokrywie pokrytej folią parafinową. Kontynuuj aktywację limfocytów B.

2. Aktywacja limfocytów B na szkiełkach nakrywkowych pokrytych antygenem

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych antygenem
   1. Przed aktywacją należy przygotować roztwór antygenu (1x PBS zawierający 10 μg/ml BCR-ligand+ i 0,5 μg/ml szczurzego anty-mysiego CD45R/B220).
   2. UWAGA: Rozważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych dzień przed testem. B220 poprawia adhezję limfocytów B, jednak BCR-Ligand+ jest wystarczający do wytworzenia odpowiedzi rozsiewającej.
   3. Umieścić szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na 24-dołkowej pokrywie płytki pokrytej folią parafinową, dodać 40 μl roztworu antygenu na każde szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Uszczelnić płytkę, aby uniknąć odparowania roztworu antygenu.
   4. Umyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS i wysusz na powietrzu.
2. Aktywacja limfocytów B
   1. Aby rozpocząć aktywację, rozcieńczyć komórki B IIA1.6 do 1,5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce CLICK + 5% FBS.
   2. Dodać 100 μl komórek na szkiełko nakrywkowe pokryte antygenem (Ag-coverslip) i aktywować w różnych punktach czasowych w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C / 5% CO_{2 .} Typowe punkty czasowe aktywacji to 0, 30 i 60 min.
      nuta: Podobnie jak w sekcji 1, zalecamy rozpoczęcie od najdłuższego punktu aktywacji, aby utrwalić wszystkie próbki w tym samym czasie.
   3. Dla czasu 0 umieścić pokrywkę 24-dołkowej płytki zawierającej szkiełko nakrywkowe Ag na lodzie i dodać komórki. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
   4. Ostrożnie zassać pożywkę na każdym szkiełku nakrywkowym Ag, a następnie dodać 100 μl zimnego 1x PBS, aby zatrzymać aktywację.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
IIA1.6 (wariant A20) mysie komórki chłoniaka B	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-208	Mysi chłoniak z komórek B pochodzenia Balb/c, który wykazuje ekspresję BCR zawierającego IgG na swojej powierzchni bez FcγIIR
CaCl2	Winkler	CA-0520 (Certyfikat CA-0520
glicyna	Winkler	Zobacz materiał BM-0820
HyClone Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Naukowy	SH30071.03	Podgrzewać w temperaturze 56 C przez 30 min
Kcl	Winkler	Zobacz materiał PO-1260
Zawartość NaCl	Winkler	SO-1455
Parafilm	M	Zobacz materiał P1150-2
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140122	ciecz
Poli-L-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P8920	Rozcieńczyć sterylną wodą
Przekaźnik RPMI-1640	Przemysł biologiczny	01-104-1A
Pirogronian sodu	Thermo Fisher Naukowy	11360070
Tubka 50 ml	Corning	353043
2-merkaptoetanol	Thermo Fisher Naukowy	21985023
glutamina	Thermo Fisher Naukowy	35050061
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	315-005-003	IIA1.6 ligand dodatni

powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: