Wpływ przeciwciała anty C-fms na osteoklastogenezę w komórkach szpiku kostnego myszy in vitro

Streszczenie

Źródło: Marahleh, A., et al. Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie osteoklastów i proliferację prekursora osteoklastów in vitro. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie pokazujemy wpływ różnych stężeń przeciwciał anty-c-fms na osteoklastogenezę, która jest procesem powstawania osteoklastów z komórek progenitorowych osteoklastów.

Protokół

1. Generacja BMM

1. Wysiew 1 x 10 7 komórek/10 ml w 10 cm naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni.
2. Po 3 dniach usunąć pożywkę hodowlaną, energicznie przemyć komórki dwukrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia nieprzylegających komórek, dodać 5 ml 0,02% trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej w PBS i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 minut.
3. Odłączyć ogniwa przez dokładne pipetowanie. Upewnij się, że komórki zostały odłączone, obserwując hodowlę pod mikroskopem (komórki powinny wydawać się zaokrąglone i unoszące się w pożywce). Jeśli komórki pozostają połączone, należy dokładnie powtórzyć pipetowanie, aby je odłączyć. Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml α-MEM, aby dezaktywować reakcję.
4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć 5 ml α-MEM.
5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml α-MEM.
6. Wykonaj zliczanie komórek.
7. Wysiew 1 x 10⁶ komórek/10 ml w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni.

2. Generowanie osteoklastów z BMM jako prekursorów osteoklastów

1. Po 3 dniach zbierz przyłączone komórki, które reprezentują BMM jako prekursory osteoklastów, wykonując kroki 1.2-1.7.
2. Wysiew BMM w 5 x 10⁴ komórkach/200 μl α-MEM na 96-dołkowej płytce. Dodaj RANKL dla końcowego stężenia 50 ng/ml lub TNF-α dla końcowego stężenia 100 ng/ml. Dodaj M-CSF do każdego dołka o końcowym stężeniu 100 ng / ml.
3. Dodaj przeciwciało anty-c-fms (końcowe stężenia 0, 1, 10, 100, 100 ng / ml) do każdej studzienki.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 dni. Zmieniaj nośniki co drugi dzień przez 4 dni.

3. Barwnik kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP)

1. Po 4 dniach inkubacji delikatnie zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę raz 200 μl o temperaturze pokojowej 1x PBS.
2. Dodaj 200 μl 10% formaliny do każdego dołka w celu utrwalenia i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać formalinę i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.
3. Dodać 200 μl 0,2% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki w celu przepuszczalności i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zassać Triton X-100 i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.
4. Do każdej studzienki dodać 200 μl roztworu plamy TRAP. Wizualizuj plamę pod mikroskopem. Potrzeba od 10-30 minut, aby plama rozwinęła się prawidłowo.
5. Zassać plamę i umyć każdą studzienkę wodą dejonizowaną 3 razy i wysuszyć na powietrzu. Przechowuj go w temperaturze pokojowej do wykorzystania w dalszej obserwacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-c-FMS			AFS98, szczurze przeciwciało monoklonalne, antymysie, c-Fms (IgG2a)
RANGL (Szerokość)	PEPROTECH	315-11	Rekombinowany mysi ligand sRANK, źródło: E.coli
M-CSF (Płyn mózgowy)			Rekombinowany ludzki M-CSF. 1/10 objętości supernatantu hodowli linii komórkowej CMG14-12 w komórkach 5X106 w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli zawiesiny.
α-MEM	Wako		z L-glutaminą i czerwienią fenolową
Surowica bydlęca płodu	Biowest (Zachód Biologi	Zobacz materiał S1820-500	Płodowa surowica bydlęca pochodzenia francuskiego
Danie hodowlane	Corning		Naczynie stylistyczne 100 mm x 20 mm
Płytka 96-dołkowa	Thermofisher Naukowy		Klon zakonnicy Powierzchnia Delta

Rozdział