1. Infekcja wirusowa u Drosophila
- Zakażone muchy za pomocą nanoiniekcji i wykonujące testy przeżycia.
- Pociągnij kapilary, aby przygotować igły do wstrzykiwań, napełnij igłę do wstrzykiwań olejem i zmontuj wtryskiwacz.
- Znieczulenie much na podkładce pod lekkim strumieniem CO2 . Zaszczepić muchy przez wstrzyknięcie do klatki piersiowej 50,6 nl roztworu wirusa (100 PFU, rozcieńczony buforem Tris-HCl, pH 7,2). Wstrzyknąć co najmniej 3 fiolki z muchami (20 much na fiolkę).
nuta: Wstrzyknięcie jest czasochłonne (zwykle 100 much na godzinę), a replikacja wirusa Drosophila C (DCV) jest bardzo szybka, dlatego bardzo ważne jest, aby zapisać dokładny czas na probówce po skończeniu każdej fiolki (20 much). Iniekcja tylko buforu jest ustawiana jako pozorowana kontrolka. Zwykle preferowane są dorosłe samce much, ponieważ wyniki są bardziej stabilne i powtarzalne niż w przypadku samic, ponieważ zmiany hormonalne podczas krycia i reprodukcji mogą wpływać na odczyt samic.
- Hoduj wstrzyknięte muchy w temperaturze 25 °C, 60% wilgotności w normalnym cyklu światła/ciemności. Codziennie zaopatruj muchy w świeże pożywienie i rejestruj liczbę martwych much.
- Wykonaj co najmniej 3 powtórzenia biologiczne i wykreśl krzywą przeżycia.
- W celu analizy statystycznej danych dotyczących przeżycia należy wygenerować krzywe przeżycia Kaplana-Meiera za pomocą oprogramowania statystycznego. Wykonaj test logarytmiczno-szeregowy, aby obliczyć wartości P. W tabeli przetrwania wprowadź informacje dla każdego tematu. Następnie oprogramowanie oblicza procent przeżycia za każdym razem i kreśli wykres przeżycia Kaplana-Meiera.
nuta: NIE dodawać dodatkowych drożdży do fiolki. W porównaniu z próbnymi kontrolami, muchy zakażone DCV czasami mają wodobrzusze i są niezdarne, co czyni je podatnymi na lepkie drożdże. Lepiej jest zapisać więcej punktów czasowych we wstępnym eksperymencie, aby dowiedzieć się, w jakich ramach czasowych nastąpi masowa śmierć zarażonych much. Ogólnie rzecz biorąc, zainfekowane muchy rzadko umierają w ciągu pierwszych dwóch dni, nawet w przypadku zmutowanych linii Dicer-2. W przypadku muchy wolnej od Wolbachii w1118 (Bloomington 5905) zakażonej 100 PFU DCV, to okno czasowe wynosi około 3-5 dni po zakażeniu. Muszki owocówki, które umierają w ciągu 0,5 godziny po wstrzyknięciu, nie powinny być liczone jako śmiertelne, ponieważ mogą zostać zabite przez zranienie igłą, a nie przez infekcję wirusową.
2. Pomiar obciążenia DCV za pomocą testu efektu cytopatycznego (CPE)
- W dniu 1 zainfekuj samce much, jak opisano w krokach 1.1.1-1.1.2. Pogrupuj muchy, którym wstrzyknięto zastrzyk, w grupy po 20 osób i utrzymuj je rosnące na świeżym pokarmie dla much przez pożądany czas (zwykle przez 24 godziny lub 3 dni). Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.
- W dniu 2 wysiewaj komórki Drosophila S2* w 10 cm naczyniu do hodowli komórkowej o gęstości około 5 x106 do 1x107 komórek/ml.
- W dniu 3 zbierz 5 much (pod lekkim przepływem CO2 ) i zmiel je w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 30 sekund z 200 μl buforu Tris i kulkami ceramicznymi za pomocą homogenizatora. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do następnego etapu.
- Dokładnie zwirować próbkę. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml i filtra 0,22 μm, aby przefiltrować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
- Wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia supernatantu z kompletną pożywką dla komórek S2*. Dodać 50 μl rozcieńczeń do studzienki. Dodać 50 μl pożywki hodowlanej bez wirusa do studzienki sklasyfikowanej jako studzienka kontroli ujemnej.
nuta: Dla każdej szybkości rozcieńczenia użyto 8 studzienek. Ponieważ typowa wydajność DCV wynosi około 108-10 9 PFU/ml, rozcieńczenie powinno obejmować co najmniej ~10-5-10-10.
- W 4 dniu obserwuj CPE za pomocą mikroskopu jasnego pola z obiektywem 20X lub 40X. Sklasyfikuj studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, jako "studnię dodatnią", a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako "studnię ujemną".
- Oznacz dodatnie lub ujemne dołki CPE odpowiednio + lub –. Obliczyć średnią dawkę infekcyjną w kulturze tkankowej wirusa (TCID50).
3. Obciążenie DCV mierzone za pomocą qRT-PCR
- W dniu 1 zainfekuj muchy, jak opisano powyżej. Wstrzykuje się w grupy samce much (20 much / grupę) i hoduje je na świeżym pokarmie dla much przez żądany czas, zwykle przez 24 godziny lub 3 dni. Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.
- W dniu 3 zbierz 5 much pod lekkim przepływem CO2 w probówce o pojemności 1,5 ml z 200 μl buforu do lizy i 20 kulkami ceramicznymi (średnica = 0,5 mm) i miel próbki za pomocą homogenizatora z dużą prędkością przez 30 s. Dodać 800 μl dodatkowego buforu do lizy do każdej probówki i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przeprowadzić ekstrakcję RNA i qRT-PCR.
- Przygotuj wolne od RNaz końcówki, rurki i dejonizowaną, dietylowęglanową (DEPC) i przefiltrowaną membranowo 0,22 μm wodę. Dodać 200 μl chloroformu (≥99,5%) do próbki i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 5 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej, aż faza wodna i faza organiczna zostaną wyraźnie oddzielone.
nuta: Chloroform jest niezwykle niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. NIE należy wirować próbki, ponieważ zwiększa to ryzyko zanieczyszczenia DNA.
- Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać 400 μl supernatantu i przenieść supernatant do nowych probówek. Wymieszać z tą samą objętością izopropanolu (≥ 99,5%), delikatnie odwrócić próbki 20 razy ręcznie, a następnie wytrącić przez 10 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej.
nuta: Wytrącanie w temperaturze -20 °C zwiększy wydajność RNA.
- Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki widoczne są białe granulki RNA.
- Wyrzucić supernatant i dodać 1 ml 70% etanolu (etanol w wodzie DEPC) i kilkakrotnie odwrócić, aby przepłukać RNA.
- Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i suchy RNA na 5-10 minut; RNA powinno stać się przezroczyste.
- Dodać 50 μl wody DEPC do próbki, kilkakrotnie pipetować i wirować.
- Weź 3 μl RNA do miareczkowania stężenia RNA. Określ ilościowo RNA przy długości fali 260 nm. Zwykle stężenie RNA ekstrahowane za pomocą tego protokołu wynosi około 100-500 μg/μL, co jest odpowiednie do syntezy cDNA.
- Użyj 2 μg RNA do syntezy cDNA. Rozcieńczyć próbkę do 100 μl roztworemddH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Wykonaj qRT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom qRT-PCR.
nuta: W przypadku syntezy cDNA DCV losowe startery działały znacznie lepiej niż startery Poly A. Ekspresja mRNA DCV jest znormalizowana do mRNA endogennego białka rybosomalnego 49 (rp49). Startery oligonukleotydowe użyte w tej części:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (do przodu) i
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (rewers);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (do przodu) i
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (rewers);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (do przodu) i
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (odwrotny);
indukowany przez wirusa RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (do przodu) i
5' GATTACAGCTGGGTGCACACA 3' (odwrócony).