$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja ludzkich monocytów i różnicowanie do makrofagów
- Pobrać antykoagulowaną krew od pozbawionych cech identyfikacyjnych zdrowych osób w regionalnym banku krwi i wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), jak wskazano poniżej.
nuta: Wykonaj wszystkie kroki w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowej. Używaj tylko sterylnych probówek i noś rękawiczki. Dodaj 10% wybielacza do wszystkich produktów związanych z krwią podczas wyrzucania. Sterylnie sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x) lub sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco (bez Ca2+ i Mg2+) mogą być stosowane zamiennie.
- Przygotować bufor do rozcieńczania: Uzupełnij 1x sterylny PBS 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
- Przygotuj pożywkę hodowlaną: Uzupełnij pożywkę RPMI-1640 o FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) i penicylinę/streptomycynę (50 I.U./50 μg/ml)
- Wstępnie schłodzić uruchomiony bufor (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
- Rozcieńczyć krew pełną dwiema objętościami buforu rozcieńczającego. Za pomocą pipety serologicznej przenieść 15 ml krwi przeciwzakrzepowej do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforu rozcieńczającego. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
- Na każde 10 ml krwi pełnej lub 30 ml rozcieńczonej krwi dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do pustej probówki o pojemności 50 ml.
- Na pożywkę o gradiencie gęstości z kroku 1.1.5 nałożyć 30 ml rozcieńczonej krwi powoli i równomiernie, używając pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Przytrzymać końcówkę pipety przy ściance probówki, a rurkę pod kątem nachylonym.
- Ostrożnie przenieś probówki do wahadłowej wirówki kubełkowej. Unikaj zakłócania obu faz. Odwirować probówki o sile 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 25 minut z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na wartość minimalną.
- Ostrożnie usuń wierzchnią (przezroczystą) warstwę osocza za pomocą pipety o pojemności 10 ml i wyrzuć ją do pojemnika z wybielaczem (10%).
- Zebrać warstwę interfazową (białą) komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs, ryc. 1) za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Połącz białą warstwę z różnych probówek tego samego dawcy w probówce o pojemności 50 ml do 30 ml.
- Doprowadzić każdą probówkę do całkowitej objętości 50 ml za pomocą buforu rozcieńczającego z kroku 1.1.1 i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i umieścić go w pojemniku z wybielaczem (10%).
- Zawiesić każdą osadkę komórkową w 1 ml wstępnie schłodzonego buforu do pracy z kroku 1.1.3 za pomocą mikropipety p1000. Połącz zawiesiny komórek od tego samego dawcy w nowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość każdej probówki do 15 ml za pomocą wstępnie schłodzonego buforu i dobrze wymieszać przez odwrócenie.
- Pobrać 20 μl porcji zawiesiny komórek z kroku 1.1.11 i przygotować rozcieńczenie 1:100 przy użyciu 1x sterylnego PBS. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować zawiesinę komórek z etapu 1.1.11 w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml. W razie potrzeby użyj mikropipety p200, aby całkowicie usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić izolowane PBMC w 80 μl wstępnie schłodzonego bufora roboczego MACS dla każdej komórki 1 x 107, dodając do maksymalnej ilości 800 μl buforu.
- Dodaj 20 μl anty-ludzkich mikrokulek CD14 na każdą 1 x 107 komórek lub do 100 μl na próbkę krwi (~100 ml nierozcieńczonej krwi). Dobrze wymieszać przez odwrócenie i umieścić na rotatorze rurowym na 20 minut z ciągłym mieszaniem w temperaturze 4 °C.
- Wyjąć próbki z rotatora probówek, dodać 10 ml wstępnie schłodzonego buforu do każdej probówki i odwirować przy 300 x g (przyspieszenie = 5, opóźnienie = 5) i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
- Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić do 1 x 108 komórek w 500 μl wstępnie schłodzonego buforu roboczego (2 x 108/ml).
- Przeprowadzić izolację komórek CD14-dodatnich poprzez sortowanie komórek magnetycznych przy użyciu systemu ręcznego lub automatycznego (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Pobrać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek z kroku 1.1.18 po selekcji CD14-dodatniej i przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:100 przy użyciu 1x sterylnego PBS. Określ liczbę komórek, licząc komórki na hemocytometrze.
- Odwirować komórki CD14-dodatnie przy 300 x g i RT przez 10 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml lub systemu próżniowego.
- Zawiesić osad komórkowy z etapu 1.1.20 we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej z etapu 1.1.2 do końcowej gęstości komórek 1 x 107 komórek/ml.
- Wysiewaj izolowane monocyty CD14-dodatnie o gęstości komórek 5 x 106 komórek.
- Na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej dodać 10 ml pożywki hodowlanej z etapu 1.1.2 uzupełnionej 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
- Dodać kroplami 0,5 ml zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.21 do pożywki hodowlanej i delikatnie zamieszać płytkę. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez noc.
- Następnego dnia odessaj pożywkę za pomocą systemu próżniowego, aby usunąć komórki, które nie przyczepiły się przez noc. Dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej z dodatkiem GM-CSF (50 ng/ml) i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez 7 dni, aby umożliwić całkowite różnicowanie (patrz rysunek 2A dla pojawienia się monocytów CD14 + na różnych etapach różnicowania w GM-CSF ). Wymieniaj pożywkę co 2-3 dni i za każdym razem uzupełniaj świeżym GM-CSF (50 ng / ml).
2. Przygotowanie komponentów do elektroporacji
UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony dla końcówki 10 μL-Neon (Tabela Materiałów). Do każdej transfekcji użyj 1-2 x 105 komórek. Zaleca się wysiewanie transfekowanych komórek na 48-dołkowej płytce lub 8-dołkowym naczyniu komorowym (10 μL-transfekowanych komórek na studzienkę). 1x sterylny DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) może być stosowany zamiast PBS.
- W dniu 7 przygotuj pożywkę wolną od antybiotyków, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 FBS (10 % (v/v)) i glutamax (2 mM).
- Umieść pożywkę RPMI-1640 bez surowicy, roztwór trypsyny-EDTA (0,25%), 1x sterylny PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i kompletną pożywkę hodowlaną z kroku 1.1.2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Jeśli używasz naczyń ze szklanym dnem (do mikroskopii konfokalnej), pokryj naczynia bromowodorkiem poli-D-lizyny.
- Pokryj 8-komorowe naczynie 200 μl bromowodorku poli-D-lizyny (0,1 mg/ml w 1x sterylnym PBS) i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać roztwór poli-D-lizyny i raz umyć szklankę 1x sterylnym PBS. Odessać PBS i przejść do kroku 2.4.
- Dodać 200 μl pożywki wolnej od antybiotyków na dołek na płytkę 48-dołkową lub naczynie z 8 dołkami i wstępnie inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) do momentu, gdy będą gotowe do umieszczenia transfekowanych komórek na płytce.
3. Przygotowanie ogniw do elektroporacji
UWAGA: Wydajność MDM z 10 cm szalki pod koniec 7-dniowego okresu różnicowania wynosi około 1,5 x 106 komórek. 1x sterylny DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) może być użyty zamiast PBS. Protokół ten został zoptymalizowany w taki sposób, aby większość makrofagów była odłączana od płytki przy zachowaniu żywotności i integralności komórek. MDM jest trudny do odłączenia od płytek do hodowli komórkowych. Dlatego może być konieczne dwukrotne wykonanie kroków 3.2 i 3.3 w celu dysocjacji komórek. Upewnij się, że czas każdej inkubacji z trypsyną-EDTA (0,25%) nie przekracza 5 minut.
- Odessać pożywkę z w pełni zróżnicowanych makrofagów na 10-centymetrowych szalkach i umyć monowarstwę komórek ciepłym pożywką RPMI-1640 bez surowicy. Upewnij się, że całkowicie usunąłeś nośnik.
- Zebrać komórki, dodając 2 ml ciepłego roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) na 10 cm naczynie i inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez 5 minut.
- Zakończ odłączanie komórek, delikatnie pipetując roztwór trypsyny-EDTA (0,25%) w górę iw dół na całej powierzchni naczynia za pomocą mikropipety p1000. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml ciepłej, kompletnej pożywki hodowlanej z etapu 1.1.2.
- Zabierz szalkę do mikroskopu jasnego pola i sprawdź, czy komórki nie odrywają się w różnych polach view. Jeśli nadal przyczepiona jest znaczna liczba komórek, powtórz kroki 3.2-3.3.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x sterylnego PBS podgrzanego do temperatury 37 °C. Weź podwielokrotność 20 μl, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Weź 1-2 x 105 komórek na planowaną transfekcję i umieść w probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić do końcowej objętości 15 ml za pomocą wstępnie podgrzanego 1x sterylnego PBS. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Zassać PBS i odwirować jeszcze raz przez 1 minutę przy 250 x g. Usuń wszelkie pozostałości PBS z osadu komórkowego za pomocą mikropipety p200.
4. Jądro składników BiFC kaspazy do ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów
UWAGA: Ta sekcja protokołu jest wykonywana przy użyciu Systemu Transfekcji Neonów (Tabela Materiałów). Protokół ten określa kroki do transfekcji 1-2 x 105 komórek za pomocą 10 μl końcówki neonowej (tabela materiałów). Jeśli używasz końcówki Neon o pojemności 100 μl, odpowiednio zwiększ skalę. Należy unikać wystawiania komórek na działanie buforu R do respensji przez dłużej niż 15 minut, ponieważ może to zmniejszyć żywotność komórek i skuteczność transfekcji.
- Rozcieńczyć plazmid reporterowy (tj. mCherry lub dsRedmito w stężeniu 100 ng / μL) w wodzie wolnej od nukleaz lub 0,5 x buforze TE, aby uwidocznić transfekowane komórki.
- Rozcieńczyć plazmidy kaspazy BiFC do odpowiedniego stężenia w wodzie wolnej od nukleaz lub 0,5x buforze TE, tak aby całkowita objętość plazmidów nie przekraczała 30% całkowitej objętości transfekcji wynoszącej 10 μL (tj. 300 ng/μL C1 Pro-VC i 300 ng/μL C1 Pro-VN).
- Przygotować 1,5 ml sterylnej mikroprobówki na planowaną transfekcję i dodać odpowiednią ilość plazmidu reporterowego (tj. 50 ng lub 0,5 μl) i plazmidów kaspazy BiFC (tj. 300 ng lub 1 μl C1 Pro-VC i 300 ng lub 1 μl fragmentu C1 Pro-VN). Trzymaj mikroprobówki w okapie przez cały czas.
- Umieść stację pipetową, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipetę w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
nuta: Stacja pipet, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipeta są zawarte w systemie transfekcji neonowej.
- Podłącz złącze wysokiego napięcia i czujnika w stacji pipetowania do tylnych portów urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Stacja pipetowania powinna znajdować się blisko urządzenia.
- Podłącz przewód zasilający do tylnego gniazda prądu przemiennego i przystąp do podłączenia urządzenia do gniazdka elektrycznego. Naciśnij wyłącznik zasilania, aby włączyć urządzenie.
- Wprowadź parametry transfekcji na ekranie startowym wyświetlanym po włączeniu i odpowiednim podłączeniu urządzenia. Naciśnij Napięcie, wprowadź 1000 i naciśnij Done, aby ustawić napięcie na 1000 V. Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij Gotowe, aby ustawić czas trwania impulsu na 40 ms. Na koniec naciśnij # Impulsy, wprowadź 2 i naciśnij Gotowe, aby ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2.
- Weź jedną z probówek do elektroporacji (dołączoną do zestawu) i napełnij ją 3 ml buforu elektrolitycznego E (na końcówki o pojemności 10 μl i dostarczone w zestawie) w temperaturze pokojowej. Włóż rurkę do elektroporacji do uchwytu na pipety na stacji pipetowej. Upewnij się, że elektroda z boku rurki jest skierowana do wewnątrz i że po włożeniu rurki słychać kliknięcie.
- Pobrać osad komórkowy z kroku 3.8 i dodać 10 μl wstępnie podgrzanego buforu R do reprodukcji (dostarczonego w zestawie) na każde 1-2 x10,5 komórek. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety p20. Dodać 10 μl zawiesiny komórek do każdej probówki ustawionej w kroku 4.3 i delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety p20.
- Weź pipetę i włóż końcówkę, naciskając przycisk na drugim ograniczniku. Upewnij się, że zacisk całkowicie podnosi trzpień mocujący tłoka w końcówce i że nie obserwuje się żadnej szczeliny w górnej głowicy pipety.
- Aby zassać próbkę, naciśnij przycisk na pipecie do pierwszego oporu i zanurz ją w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę DNA komórki/plazmidu. Powoli zasysać mieszaninę do końcówki pipety.
nuta: Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować iskrzenie łukowe podczas elektroporacji, a jeśli zostaną wykryte przez urządzenie, mogą uniemożliwić dostarczenie impulsu elektrycznego. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki powietrza, uwolnij zawartość do probówki i spróbuj ponownie zassać.
- Ostrożnie włożyć pipetę z próbką do uchwytu na pipety. Upewnij się, że pipeta klika i że jest prawidłowo umieszczona.
- Naciśnij Start na ekranie dotykowym i poczekaj, aż zostaną dostarczone impulsy elektryczne. Na ekranie pojawi się komunikat informujący o zakończeniu.
- Powoli wyjąć pipetę ze stacji i natychmiast dodać transfekowaną zawiesinę komórek do odpowiedniego dołka z wstępnie podgrzaną pożywką wolną od antybiotyków z kroku 2.4, powoli naciskając przycisk do pierwszego oporu.
nuta: Ta końcówka może być ponownie użyta do trzech razy dla tego samego plazmidu; w przeciwnym razie wyrzuć go do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, naciskając przycisk do drugiego zatrzymania.
- Powtórzyć kroki 4.10-4.14 dla każdej probówki zawierającej mieszaninę DNA komórka/plazmid.
- Delikatnie kołysać płytką z transfekowanymi komórkami i inkubować przez 1-3 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
- Dodać do każdej studzienki 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki (kompletnej pożywki) z kroku 1.1.2. Ponownie umieścić naczynie w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Odczekać co najmniej 24 godziny na ekspresję genów.
- Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
- Włącz mikroskop epifluorescencyjny i skrzynkę fluorescencyjnego źródła światła zgodnie z instrukcjami producenta i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.
- Wybierz obiektyw 10x lub 20x i filtr 568 nm (RFP).
- Aby oszacować żywotność komórki, naciśnij przycisk diody LED światła przechodzącego (TL), aby wyświetlić wszystkie komórki w wybranym polu. Patrząc w okular mikroskopu, obracaj pokrętłem ostrości, aż zaobserwujesz komórki i sprawdź, czy komórki są przyczepione w wybranym polu.
nuta: W pełni przyłączone komórki reprezentują komórki żywotne, podczas gdy komórki pływające reprezentują komórki nieżywotne. Jeśli konfluencja studni jest wysoka, obecność nieprzyłączonych komórek może być wynikiem przeszacowania liczby komórek, a nie wynikiem niskiej żywotności. Jednak niska konfluencja, której towarzyszy wysoka zawartość pływających komórek, oznacza niską żywotność, która może wynikać z wyładowań łukowych podczas elektroporacji, toksyczności plazmidu lub nadmiernej ekspozycji na bufor R do rezawiesiny. Nie używaj studzienek, które wykazują to drugie zachowanie.
- Aby oszacować wydajność transfekcji, skoncentruj się na komórkach w wybranym polu w świetle przechodzącym, jak opisano powyżej. Policz łączną liczbę komórek w zaznaczonym polu. Gdy dioda LED światła przechodzącego (TL) jest wyłączona, naciśnij przycisk LED światła odbitego (RL), aby włączyć.
- Dokładnie skoncentruj się na fluorescencji genu reporterowego (krwinki czerwone) i policz całkowitą liczbę komórek czerwonej fluorescencji. Powtórz te kroki (4.18.4-4.18.5) dla co najmniej dwóch dodatkowych pól na studzienkę.
5. Leczenie transfekowanego MDM i akwizycji danych BiFC przez transfekowane MDM i kaspazę
UWAGA: Jeśli planujesz obrazować komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, zaleca się leczenie qVD-OPh (20 μM) przez 1 godzinę przed leczeniem wybranym bodźcem, aby zapobiec śmierci komórek zależnej od kaspazy (głównie apoptozie). Jest to wykorzystywane w obrazowaniu, aby zapobiec unoszeniu się komórek z powodu apoptozy, co bardzo utrudnia ich obrazowanie, gdy wychodzą poza płaszczyznę ogniskową. Należy zauważyć, że rekrutacja kaspazy do platformy aktywacyjnej i związana z nią kaspaza BiFC nie jest zależna od aktywności katalitycznej kaspazy, a w konsekwencji hamowanie kaspazy nie wpłynie na ten krok.
- Leczyć wybranym bodźcem około 24 godziny po transfekcji i inkubować tak długo, jak jest to konieczne dla każdego leku.
- Przygotować pożywkę do obrazowania, uzupełniając pożywkę z etapu 1.1.2 Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) i 2-merkaptoetanolem (55 μM).
- Dodać żądane stężenie bodźca do wstępnie podgrzanego podłoża obrazowego i delikatnie wymieszać.
- Ostrożnie usunąć pożywkę z komórek za pomocą mikropipety p1000 i dodać 500 μl roztworu stymulującego z kroku 5.1.2 w dół po ścianie studzienki.
- Aby uruchomić nieoczyszczone studzienki kontrolne, dodaj pożywkę obrazującą bez bodźca.
- Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) tak długo, jak jest to wskazane dla każdego zabiegu.
- Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.
- Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wybierz obiektyw 10x lub 20x i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.
- Za pomocą okularu mikroskopu znajdź komórki pod filtrem 568 nm i skup się na komórkach wyrażających reporter dsRedmito/mCherry (krwinki czerwone).
- Policz wszystkie czerwone komórki w polu widzenia i zapisz liczbę.
- Będąc w tym samym polu widzenia, zmień filtry na 488 lub 512 (GFP lub YFP), przystąp do liczenia czerwonych krwinek, które są również zielone (Wenus-dodatnie lub BiFC-dodatnie) i zapisz liczbę.
- Policz co najmniej 100 komórek dodatnich dsRedmito/mCherry z co najmniej trzech indywidualnych pól widzenia.
