Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie do WS-CM
- Wygeneruj całe medium kondycjonowane dymem (WS-CM) zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Przygotuj WS-CM, przepuszczając dym z czterech papierosów referencyjnych 3R4F przez podłoże Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej, stosując następujący schemat palenia: odpowiednio 35-60-2, objętość zaciągnięcia w ml, odstęp między zaciągnięciami w sekundach i czas zaciągnięcia w sekundach. Z każdego preparatu pobierana jest próbka o objętości 20 ml.
- Oznacz rurkę (tuby) datą, godziną zakończenia oraz nazwą i numerem papierosa. Przechowywać 500 μl porcji w temperaturze -80 °C natychmiast po zakończeniu wędzenia.
- Przeanalizuj podwielokrotności zamrożonego WS-CM, aby określić poziomy nikotyny, nitrozoamin specyficznych dla tytoniu i wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, jak opisano wcześniej.
2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC
- Pobranie świeżej krwi od zdrowych dawców (którzy nie są konsumentami wyrobów tytoniowych) Odizoluj PBMC od świeżej krwi, jak opisano poniżej.
- Przed przybyciem worka na krew należy przygotować butelkę o pojemności 500 ml, nożyczki, bufor izolacyjny i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) (RT) firmy Dulbecco w kapturze do hodowli komórkowych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Bufor izolacyjny musi być chroniony przed światłem.
- Trzymaj worek na krew do góry nogami i przetnij rurkę tuż poniżej miejsca, w którym została zaciśnięta, pozostawiając co najmniej 3 cm rurki.
- Zdjąć nakrętkę z butelki o pojemności 500 ml i przytrzymać probówkę nad otworem butelki. Podnieś worek na krew i odwróć go, aby krew mogła swobodnie przepływać z worka do butelki, aż worek będzie pusty. Pozwól, aby krew spłynęła na wewnętrzną ściankę butelki, a nie prosto w dół, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków.
- Wlać bufor izolacyjny do butelki w stosunku 1:5 buforu izolacyjnego do krwi. Szczelnie zakręć butelkę i delikatnie odwróć ją od końca do końca, 10 razy. Pozostawić butelkę w kapturze do hodowli komórkowej do inkubacji przy wyłączonym świetle, na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Nad krwią utworzy się jasna, słomkowa warstwa. Usunąć tę warstwę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Pobrana ilość może wahać się od 50 do 300 ml, w zależności od osoby, która oddała krew.
- Odwirować probówki o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać półprzezroczysty supernatant, pozostawiając ciemny krwisty granul. Granulka będzie luźna, ale lepka.
- Odpipetować 3 ml buforu izolacyjnego do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
- Do zawieszonego osadu dodać 20 ml DPBS na każde 50 ml cieczy o barwie słomkowej zebranej w kroku 2.1.5. Wirować, aby dokładnie wymieszać i skonsolidować zawieszoną ciecz z wielu probówek. Ten płyn zawiera zawieszone krwinki.
- Za pomocą pipety do przenoszenia przenieść 5 ml zawieszonych krwinek na 3 ml buforu izolacyjnego zgodnie z krokiem 2.1.8. Powoli i delikatnie przechylić stożkową probówkę o pojemności 15 ml, która zawiera zawiesinę komórek, aby utworzyć dwie oddzielne warstwy. Wirować probówki o sile 400 x g przez 40 minut przy temperaturze pokojowej przy minimalnym przyspieszeniu i bez hamulca.
- Za pomocą pipety transferowej usunąć powstałą mętną warstwę środkową (kożuchową powłokę) zawierającą PBMC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Unikaj rysowania innych przezroczystych warstw pod nim. Przenieść nie więcej niż 25 ml do każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Dodać 25 ml buforu do pracy na zimno (lub więcej, aby wypełnić całą pozostałą objętość stożkowej probówki o pojemności 50 ml) w celu przemycia komórek. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad za pomocą 10 ml buforu bieżącego. Zawiera PBMCs. Policz komórki i użyj ich natychmiast lub umieść je na lodzie w celu zamrożenia.
3. Zamrażanie i rozmrażanie PBMC
- Odwirować jednojądrzaste komórki krwi kropelkowej (PBMC), które zostały zebrane w kroku 2.1.13, przez 10 minut przy 400 x g.
- Napełnij pojemnik do zamrażania alkoholem izopropylowym zgodnie z instrukcjami producenta.
ostrożność: Alkohol izopropylowy jest łatwopalny i silnie toksyczny.
- Zawiesić osad za pomocą pożywki RPMI 1640 (4 °C) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Jest to medium zamrażające RPMI 1640. Zawiesić osad z taką ilością pożywki do zamrażania, że w wyniku zawiesiny będzie miała około 5 x 107 komórek/ml. Liczba komórek dostępnych do zamrożenia będzie się różnić.
- Dozować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do 2 ml krioprobówek i umieścić krioprobówki w pojemniku do zamrażania. Umieścić pojemnik do zamrażania z krioprobówkami w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przechowywania O/N, a następnie wyjąć krioprobówki i przenieść do przechowywania w zamrażarce kriogenicznej w temperaturze od -150 °C do -190 °C.
- Wyjąć krioprobówkę z magazynu kriogenicznego i szybko ją rozmrozić, delikatnie mieszając, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Natychmiast przenieś rozmrożone PBMC w krioprobówce do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml RPMI 1640 kompletnej pożywki (4 °C) zawierającej 10% FBS, 1% Pen/Strep i 1% L-glutaminy. Zawartość rozmrożonej krioprobówki powinna zostać przeniesiona tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać maksymalną żywotność komórek.
- Odwirować PBMC przy 400 x g przez 10 minut.
- Zawiesić osad za pomocą 5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 i policzyć komórki.
- Zmierz żywotność komórek za pomocą ustalonych metod, takich jak metoda wykluczania błękitu trypanowego. Ogólnie rzecz biorąc, żywotność komórek tą metodą wynosi około 90 - 95%. PBMC są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.
4. Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa
UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia są przeznaczone do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio dostosować.
- Rozcieńczyć WS-CM w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę przy stężeniu 0,3, 1,56, 3 i 5 μg/ml jednostek ekwitonikotyny.
- Na tej samej płytce rozcieńczyć nikotynę do następujących stężeń: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 i 4000 μg/ml.
ostrożność: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
- Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI o stężeniu 1 ×10 6 komórek/basenik. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.
- Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przemyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie z stężeniem 300 × g przez 3 minuty, zasysając supernatant, wirując dno płytki z przykrytą płytką, a na koniec ponownie zawieszając komórki za pomocą 200 μl lodowatego buforu i powtórzyć etap przemywania jeszcze raz.
- Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI na płytkę i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
- Przygotować stężenia robocze 2 μl/ml GolgiPlug i 10 μg/ml LPS przy użyciu kompletnego podłoża RPMI i dodać 200 μl do każdej studzienki.
- Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Pod koniec kroku 9.8 przemyć komórki buforem (4 °C) i wirować w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Dodać 100 μl Cytofix do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Umyj komórki 3 razy, jak opisano w kroku 9.9, za pomocą 1x Permwash (4 °C) w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.
- Dodaj 45 μl 1x Cytoperm do każdej studzienki, a następnie 5 μl każdego z następujących przeciwciał do każdej studzienki: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
- Przemyć komórki dwa razy, jak opisano w kroku 9.9, 1x Permwash (4 °C) i jeden raz z buforem (4 °C) przy 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.
- Zawiesić komórki za pomocą 200 μl 2% paraformaldehydu (4 °C). Przenieś komórki do probówek o średnicy 12 × 75 mm i przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym.
ostrożność: Paraformaldehyd jest, silnie toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia.
