Synteza biofilmu in vitro przez Staphylococcus aureus

Streszczenie

Źródło: Rana, P. S. et al., Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określania interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

W tym filmie pokazujemy przygotowanie biofilmu in vitro przez S. aureus na wielodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną. Płytka uformowana w biofilm może być wykorzystana do dalszych eksperymentów.

Protokół

1. Przygotowanie biofilmu in vitro

1. Uzyskać izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego materiału przy użyciu techniki smugowej płytki na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak agar sojowy tryptyczny (patrz tabela materiałów).
2. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnym_H2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
   nuta: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
3. Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD_{600 nm}) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę średniologarytmiczną do OD_600nm 0,1.
5. Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
   nuta: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak μ-kanałowe szkiełka (patrz tabela materiałów).
6. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
   nuta: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas płukania, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
7. Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
   nuta: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili
.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Bacto Tryptyczny bulion sojowy	Bd	DF0370-07-5	Połącz z 1,5% agarem, aby uzyskać agar sojowy Tryptic
Przezroczyste 96-dołkowe płyty polistyrenowe z płaskim dnem	Costar	3370
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma	Zobacz materiał P4707-50ML
Białe, nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe	sokół	353296	Hodowla tkankowa poddana działaniu i płytka z płaskim dnem
Minimalna ilość niezbędnych nośników (MEM) Alpha 1x	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 41061-029

szt.