Synteza biofilmu in vitro przez Staphylococcus aureus

1. Przygotowanie biofilmu in vitro

1. Uzyskać izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego materiału przy użyciu techniki smugowej płytki na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak agar sojowy tryptyczny (patrz tabela materiałów).
2. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnym_H2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
   nuta: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
3. Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD_{600 nm}) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę średniologarytmiczną do OD_600nm 0,1.
5. Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
   nuta: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak μ-kanałowe szkiełka (patrz tabela materiałów).
6. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
   nuta: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas płukania, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
7. Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
   nuta: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili
.