1. Preparat antygenowy
UWAGA: Trzy różne preparaty antygenowe mogą być użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej na Hi. Są to: 1) składnik subkomórkowy (zwykle ze ściany komórkowej bakterii); 2) zabite i inaktywowane bakterie; oraz 3) żywe bakterie. Określić zastosowanie każdego preparatu antygenowego przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.
- Składniki subkomórkowe
- Pozyskiwanie składników subkomórkowych ze źródeł, w tym preparatów komercyjnych, składników opracowanych przez nas i/lub od innych badaczy.
nuta: Można stosować składniki subkomórkowe zwykle ze ściany komórkowej bakterii i obejmują białka błony zewnętrznej, takie jak P6 i lipooligosacharyd (LOS). Te subkomórkowe składniki są zwykle pozyskiwane w wyspecjalizowanych ośrodkach. Opis tego, jak są wykonane, wykracza poza zakres tego artykułu. W celu uzyskania tych składników zaleca się bezpośredni kontakt z ekspertami w tej dziedzinie.
- Bakterie zabite/inaktywowane
- Pobrać bakterie z odpowiedniej próbki (np. plwociny lub bronchoskopii). Potwierdzić szczep jako H. influenzae za pomocą odpowiedniego laboratorium mikrobiologicznego. Wykonaj typowanie próbek H. influenzae, aby potwierdzić, że nie nadają się do opisania (NTHi, przez specjalistyczne laboratorium mikrobiologiczne).
- Aby uzyskać reprezentatywny antygen, należy użyć wielu szczepów NTHi (co najmniej 5, każdy w przybliżeniu tej samej ilości) w celu wytworzenia połączonego antygenu. Szczepy należy przechowywać w temperaturze -70 °C w bulionie glicerolowym w probówkach do mikrowirówek.
nuta: W tym eksperymencie wykorzystano dziesięć różnych szczepów.
- Rozmrozić szczepy (po jednej probówce mikrowirówkowej na raz) na czekoladowych płytkach agarowych i hodować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dodaj bakterie do 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umyj je dwukrotnie (wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut). Użyć wzorca MacFarlanda lub spektrofotometru, aby podwielokrotnić NTHi do stężenia10-8 ml (przy użyciu pojemnika o pojemności 5 ml lub równoważnika).
- Ciepło dezaktywuje bakterie, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 10 minut.
- Sonikuj bakterie za pomocą ciągłego ustawienia sonikacji z prędkością od niskiej do średniej przez 30 sekund.
- Podwielokrotność odpowiedniej objętości próbek należy rozmieścić w probówkach do mikrowirówek. W przypadku próbki o objętości10-8 ml należy użyć podwielokrotności 50 μl (tj. 20 próbek na ml) i zamrozić je w temperaturze -70 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
- Żywe bakterie
- Najpierw scharakteryzuj żywe bakterie, jak wspomniano w kroku 1.2.1. Użyj jednego dobrze scharakteryzowanego szczepu. Upewnij się, że szczep jest również przechowywany w bulionie glicerolowym w temperaturze -70 °C jako rezerwa.
- Hoduj bakterie na wzbogaconych podłożach, takich jak czekoladowe talerze agarowe lub w bulionie.
- Aby użyć czekoladowych talerzy agarowych, rozprowadzaj bakterie co najmniej co 3-4 dni za pomocą sterylnych rozsiewaczy.
- Alternatywnie użyj bulionu Brain Heart Infusion (BHI) wzbogaconego w czynniki X (hemina) i V (dinukleotyd adeninowy β-nikotynamidu) do hodowli bakterii. Zaszczepić NTHi z nocnych szalek w 5-10 ml bulionu BHI uzupełnionego dinukleotydem heminy i β-nikotynamidoadeniny (oba 10 μg/ml) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
nuta: Ma to tę zaletę, że jest odtwarzalny, ma wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) i wszystkie bakterie są w podobnej fazie wzrostu logarytmicznego (na płytkach żywotność bakterii może być większa w zależności od pozycji w kulturze).
- Użyj wielokrotności infekcji (MOI) 100 bakterii w jednej komórce, aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Użyj standardu MacFarland lub spektrofotometru, aby ocenić liczbę bakterii.
- Upewnij się, że pożywka używana do testów NTHi na żywo jest wolna od jakiejkolwiek ludzkiej surowicy, ponieważ spowoduje to zabicie bakterii. Próbki surowicy zwierzęcej (np. płodowa surowica cielęca) na ogół nie powodują żadnych problemów.
nuta: Metody opisane poniżej służą do analizy standardowych próbek tkanek, takich jak krew obwodowa, próbki bronchoskopowe (w szczególności płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)) i wycięta tkanka płucna. Próbki należy inkubować z antygenem Hi przez 10 minut do 24 godzin lub dłużej.
2. Ocena funkcji limfocytów we krwi obwodowej
- Do testów cytometrii przepływowej należy stosować preparaty krwi pełnej lub komórek jednojądrzastych.
- Pobieraj próbki od każdego obiektu przez nakłucie żyły. Zebrać 4 ml krwi z żyły obwodowej w probówce z heparyną litową i podzielić próbki na podwielokrotności w celu kontroli i stymulacji antygenu.
- Dodać przeciwciała kostymulujące (anty-CD28 i CD49d, 1 μL/ml) do obu próbek. Dodać NTHi do próbki antygenu i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. W przypadku zabitego preparatu NTHi dodać 200 μl antygenu do 2 ml krwi. W przypadku żywych NTHi dodaj żywe komórki NTHi o MOI 100:1 do białych krwinek (mierzonych hemocytometrem).
- Dodać do próbek środek blokujący Golgiego Brefeldin A (10 μl/ml) i inkubować je przez kolejne 5 godzin
nuta: Zablokowanie aparatu Golgiego zapobiega eksportowi cytokin na zewnątrz komórki.
- Jeśli używana jest krew pełna, należy poddać erytrocyty lizie 0,8% chlorku amonu, aby w roztworze pozostały tylko leukocyty. Utrwal leukocyty za pomocą 500 μl 1%-2% paraformaldehydu przez 1 godzinę.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru, przepuszczaj 106 komórek 100 μl 0,1% saponiny przez 15 minut i inkubuj komórki z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego.
nuta: Ilość przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie będzie specyficzna dla każdej cytokiny. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj 106 komórek w 100 μl roztworu będzie barwionych przez 1 godzinę. Większość komercyjnie uzyskanych przeciwciał wystarczy do wykonania 25-100 testów.
- Określ proporcję komórek reagujących na antygen poprzez bramkowanie odpowiedniej populacji limfocytów (komórki są bramkowane przez CD45, następnie przez CD3, a później przez ekspresję CD4 lub CD8), jak pokazano na rysunku 1. Wykonaj barwienie tła na niestymulowanych komórkach dla wszystkich cytokin, które mają być analizowane. Przebadaj 100 000 komórek, aby przeanalizować każdą cytokinę zarówno pod kątem stymulowanych komórek, jak i kontroli.
