$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Preparat antygenowy
- Żywe bakterie
- Po pierwsze, scharakteryzuj żywe bakterie. Pobrać bakterie z odpowiedniej próbki (np. plwociny lub bronchoskopii). Potwierdzić szczep jako Haemophilus influenzae, korzystając z odpowiedniego laboratorium mikrobiologicznego. Wykonaj typowanie próbek H. influenzae, aby potwierdzić, że nie nadają się do pisania (przez specjalistyczne laboratorium mikrobiologiczne). Użyj jednego dobrze scharakteryzowanego szczepu. Upewnij się, że szczep jest również przechowywany w bulionie glicerolowym w temperaturze -70 °C jako rezerwa.
- Hoduj bakterie na wzbogaconych podłożach, takich jak czekoladowe talerze agarowe lub w bulionie.
- Aby użyć czekoladowych talerzy agarowych, rozprowadzaj bakterie co najmniej co 3-4 dni za pomocą sterylnych rozsiewaczy.
- Alternatywnie użyj bulionu Brain Heart Infusion (BHI) wzbogaconego w czynniki X (hemina) i V (dinukleotyd adeninowy β-nikotynamidu) do hodowli bakterii. Zaszczepić nietypizujące H. influenzae (NTHi) z nocnych płytek w 5-10 ml bulionu BHI uzupełnionego zarówno heminą, jak β i dinukleotydem adeninowo-nikotynamidoadeninowym (oba 10 μg/ml) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, CO2 .
nuta: Ma to tę zaletę, że jest odtwarzalny, ma wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) i wszystkie bakterie są w podobnej fazie wzrostu logarytmicznego (na płytkach żywotność bakterii może być większa w zależności od pozycji w kulturze).
- Użyj wielokrotności infekcji (MOI) 100 bakterii w jednej komórce, aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Użyj standardu MacFarland lub spektrofotometru, aby ocenić liczbę bakterii.
- Upewnij się, że pożywka używana do testów NTHi na żywo jest wolna od jakiejkolwiek ludzkiej surowicy, ponieważ spowoduje to zabicie bakterii. Próbki surowicy zwierzęcej (np. płodowa surowica cielęca) na ogół nie powodują żadnych problemów.
UWAGA: Metody opisane poniżej należy stosować do analizy standardowych próbek tkanek, takich jak krew obwodowa, próbki bronchoskopowe (w szczególności płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL)) oraz wycięta tkanka płucna. Próbki należy inkubować z antygenem Hi przez 10 minut do 24 godzin lub dłużej.
2. Ocena funkcji limfocytów/mediatorów stanu zapalnego w tkance płucnej
- Zwykle nie jest możliwe uzyskanie wystarczającej liczby limfocytów z bronchoskopii, dlatego należy użyć tkanki płucnej z próbek po lobektomii. Optymalizacja próbek tkanki płucnej wymaga ścisłej współpracy ze służbą patologii anatomicznej. Upewnij się, że tkanka ma margines co najmniej 3 cm od guza i jest tkanką komórkową bez znaczącej rozedmy płuc (zgodnie z ustaleniami patologa).
- Rozbij tkankę płucną na zawiesinę komórkową, zanim będzie można ją wykorzystać do testów cytometrii przepływowej. Tkankę płucną trawić chemicznie (np. kolagenazą) lub dezagregować mechanicznie.
nuta: Mechaniczna dezagregacja tkanki może być preferowana, ponieważ wiąże się to z lepszym barwieniem powierzchni komórek (np. znakowanie CD3/4).
- Uzyskaj próbki lobektomii od patologa (zwykle uzyskiwane od pacjentów poddawanych leczeniu raka płuc). Pokrój około 20-40 g próbki na3-5 mm 3 sekcje. Umieść je w sterylnej komorze o pojemności 50 μl, a następnie poddaj je mechanicznemu rozdrobnieniu za pomocą odpowiedniego deagregatora.
- Po dezagregacji tkanek poddać erytrocyty lizie roztworem 0,8% chlorku amonu (150 mM chlorku amonu (NH4Cl), 1 mM wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 0,1 mM roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
nuta: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system, taki jak Q-prep.
- Ponownie zawiesić komórki w sterylnym RPMI (objętość będzie zależeć od liczby komórek i zwykle wynosi 10-20 ml), a następnie przefiltruj je przez sterylną siatkę nylonową o wielkości 100 μm. Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.
3. Test infekcji NTHi
- Zawiesić komórki płuc do końcowego stężenia komórek 4 x 106 komórek/ml na probówkę (próbki kontrolne i stymulowane).
- Użyj zawiesiny 4 x 106-6 x 106 komórek w 1 ml RPMI dla probówki kontrolnej (ujemnej). Tę samą ilość należy zastosować do probówki NTHi (każda dodatkowa próbka może być użyta jako kontrola pozytywna z superantygenem gronkowcowym E (SEB). Zainfekuj komórki w probówce NTHi przy MOI 100 bakterii na komórkę. Poluzuj nasadkę o pół obrotu, aby umożliwić przepływ gazu w rurkach.
- Umieścić komórki w rotatorze probówkowym i inkubować je w temperaturze 37 °C, obracając się z prędkością 12 obr./min.
- Aby zapobiec zewnątrzkomórkowemu eksportowi cytokin, należy dodać bloker Golgiego (Brefeldin A) do zawiesin komórkowych 1 godzinę po stymulacji do końcowego stężenia 10 μg/ml. Zwróć zawiesiny komórek na kolejne 16-22 godziny inkubacji na zmianę.
- Przepłukać zawiesinę komórkową 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,01% azydku sodu,NaN 3.
- Dodać przeciwciała do barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (wybór przeciwciał zostanie określony przez badacza). Wybarwić zawiesinę komórkową pod kątem określonych markerów powierzchniowych ludzkich limfocytów (np. CD45, CD3 itp.) przez 1 godzinę. Umyj komórki PBS, utrwal je i przepuszczalność.
- Utrwal komórki za pomocą 500 μl 1%-2% paraformaldehydu przez 1 godzinę.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru, przepuszczaj 106 komórek 100 μl 0,1% saponiny przez 15 minut i inkubuj komórki z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego.
nuta: Ilość przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie będzie specyficzna dla każdej cytokiny. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj 106 komórek w 100 μl roztworu będzie barwionych przez 1 godzinę. Większość komercyjnie uzyskanych przeciwciał wystarczy do wykonania 25-100 testów.
- Inkubować komórki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami barwiącymi cytokiny (np. interferonem gamma, IFN-γ i czynnikiem martwicy nowotworu beta, TNF-α lub interleukiną, IL-13 i IL-17A) przez 1 godz.
nuta: Zaleca się najpierw barwienie markerów powierzchniowych, a następnie wewnątrzkomórkowych, ponieważ utrwalenie może powodować zmiany konformacyjne w białkach powierzchniowych, do których wiążą się przeciwciała.
- Przemyć komórki 500 μl PBS i ponownie zamieszać w 100 μl PBS przed pobraniem danych na cytometrze przepływowym.