Oznaczanie produkcji ROS przez neutrofile po interakcji z opsonizowanym biofilmem

Streszczenie

Źródło: Rana, P. S. J. B., et al. Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

W tym filmie demonstrujemy test chemiluminescencji in vitro, który wykrywa wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez neutrofile po wystawieniu na działanie opsonizowanego biofilmu bakteryjnego.

Protokół

1. Pomiar ROS wytwarzanych przez neutrofile

1. Dodać kroplami 100 μl 20% normalnej surowicy ludzkiej (rozcieńczonej w HBSS) do przemytego biofilmu i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych przez 30 minut w celu opsonizacji biofilmu.
2. Odessać 20% roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 μl HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami.
   nuta: Do interpretacji eksperymentu zalecane są co najmniej cztery grupy: (A) neutrofile + biofilm, (B) neutrofile + PMA (kontrola pozytywna, patrz tabela materiałów), (C) tylko neutrofile i (D) tylko biofilm.
3. Dodać luminol (patrz tabela materiałów) do neutrofili zawieszonych w HBSS w stężeniu 4 x 10⁶ komórek/ml tak, aby końcowe stężenie luminolu wynosiło 50 μM. To rozwiązanie jest gotowe do użycia dla grup (A) i (C). Dodaj 4 x 10⁵ neutrofili zmieszanych z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami.
4. W oddzielnej probówce przygotować 50 μM roztwór luminolu w HBSS bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm (grupa D).
5. Podwielokrotność 350 μl neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać do mieszaniny 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) o końcowym stężeniu 500 ng/ml. Dla grupy (B) dodać 4 x 10⁵ neutrofili z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna.
   nuta: Stężenie PMA wskazane na tym etapie jest stosunkowo wysokie, aby zapewnić silną odpowiedź impulsową, ponieważ neutrofile stymulowane PMA są kontrolą pozytywną. PMA może być stosowany w niższym stężeniu do aktywacji neutrofili, w zależności od eksperymentu.
6. Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
7. Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 °C wraz z ustawieniem luminescencji i odczytu kinetycznego przez 60 minut w odstępach 3-minutowych. Umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 min.
   nuta: Na potrzeby tego testu biofilmy hodowano na białych płytkach używanych do testów luminescencyjnych. PMA jest znanym agonistą odpowiedzi oksydacyjnej. Podczas wykonywania badań z udziałem PMA należy upewnić się, że PMA jest dodawany na ostatnim etapie, gdy roztwór zawierający neutrofile jest zimny, ponieważ PMA natychmiast inicjuje odpowiedź burst.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Thermo Scientific	339652
Wacik nasączony alkoholem	Bd		Służy do pobierania krwi
Licznik komórek	Zaopatrzenie w bal	Zobacz materiał 202C
Przezroczyste 96-dołkowe płyty polistyrenowe z płaskim dnem	Costar	3370
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco 1x	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej
Hemocytometr	Jasna linia
Luminol (Luminol)	Sigma	A8511-5G
Minimalna ilość niezbędnych nośników (MEM) Alpha 1x	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 41061-029
Normalna surowica ludzka	Technologia uzupełniania	Nhs
Szalka Petriego (100 x 15 mm)	Firma VWR	25384-342
12-mirystynian 13-octanu forbolu
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma	Zobacz materiał P4707-50ML
Oprogramowanie SoftMax Pro	Urządzenia molekularne		Oprogramowanie czytnika mikropłytek używane do akwizycji danych
SpectraMax i3x	Urządzenia molekularne		Czytnik mikropłytek

szt.