Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Streszczenie

Źródło: Rana, P. S. J. B., et al. Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

1. Przygotowanie biofilmu in vitro

1. Uzyskać izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego materiału przy użyciu techniki smugowej płytki na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak agar sojowy tryptyczny (patrz tabela materiałów).
2. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnym_H2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
   nuta: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
3. Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD₆₀₀nm) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę środkowologarytmiczną do OD₆₀₀nm wynoszącego 0,1.
5. Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
   nuta: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak μ-kanałowe szkiełka (patrz tabela materiałów).
6. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
   nuta: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas płukania, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
7. Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
   nuta: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili
.

2. Izolacja neutrofili

UWAGA: Neutrofile zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi zmianami. Ten protokół izolacji łączy najpierw wirowanie w gradionym gradiacji gęstości, a następnie 3% sedymentację dekstranu. W tej sekcji omówiono tylko ogólny protokół izolacji neutrofili, koncentrując się na zmianach wprowadzonych do opublikowanego protokołu. Co więcej, opisany poniżej protokół jest jedną z wielu metod, które mogą izolować neutrofile i mogą być zastąpione w razie potrzeby. Inne metody izolowania neutrofili obejmują użycie pożywek do separacji komórek lub magnetycznej separacji komórek przeciwciał.

1. Pobrać krew od dorosłego dawcy poprzez wkłucie żyły, zgodnie z protokołem przedstawionym w instytucjonalnym IRB. Przed pobraniem krwi należy upewnić się, że w strzykawce znajduje się wystarczająca ilość heparyny wolnej od konserwantów, tak aby końcowe stężenie heparyny wynosiło 20 j./ml.
2. Rozcieńczyć krew heparynizowaną 3/4 objętości 0,9% NaCl wolnego od endotoksyn (patrz tabela materiałów) w H₂O w temperaturze pokojowej.
3. Na każde 20 ml rozcieńczonej próbki krwi należy dodać 14 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce o gradiencie gęstości.
4. Odwirować warstwową próbkę krwi o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka ma powolną przerwę, aby uniknąć naruszenia warstwy po zakończeniu wirowania.
   nuta: Próbka krwi będzie miała pięć warstw zawierających mieszaninę soli fizjologicznej i osocza, warstwę komórek jednojądrzastych, pożywkę gradientu gęstości, neutrofile i erytrocyty.
5. Za pomocą pipety serologicznej odessać wszystkie warstwy powyżej neutrofili i osadu erytrocytów, a następnie delikatnie zawiesić osad w zimnym, wolnym od endotoksyn 0,9% NaCl w_H2O. Dla każdej osadki wytworzonej z 20 ml próbki krwi należy ponownie zawiesić osad z powrotem do całkowitej objętości 20 ml. Dodać 3% dekstranu w stosunku 1:1 (patrz Tabela Materiałów). Inkubować probówkę w pozycji pionowej przez 18-20 minut na lodzie.
   nuta: Upewnij się, że 3% dekstran jest wykonany z wolnego od endotoksyn 0,9% NaCl w H₂O.
6. Usunąć 20 ml górnej warstwy zawierającej neutrofile i niektóre erytrocyty na nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 355 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odleć supernatant, pozostawiając czerwoną osadkę.
7. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml zimnego, sterylnego_H2Ona 30 sekund w celu lizy pozostałych erytrocytów. Natychmiast dodaj 10 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn do mieszaniny, aby przywrócić toniczność. Odwirować roztwór o stężeniu 233 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
8. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający 95%-97% neutrofili w 1 ml zimnego HBSS na 20 ml próbki krwi.
9. Przenieść 10 μl zawieszonych neutrofili w 90 μl 0,4% barwnika wykluczającego błękit trypanowy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).
   nuta: Komórki niezdolne do życia są barwione na niebiesko, ponieważ barwnik wykluczający błękit trypanowy jest nieprzepuszczalny w komórkach żywotnych. Protokół ten zapewnia >99% żywotności komórek.
10. Dodać dodatkowe HBSS tak, aby końcowe stężenie neutrofili wynosiło 4 x 10⁶ komórek/ml.
    nuta: W przypadku <99% żywotności komórek nadal można osiągnąć końcowe stężenie 4 x 10⁶ komórek/ml; jednak całkowita objętość roztworu zawierającego 4 x 10⁶ komórek/ml uzyskana zmniejszy się. Końcowe stężenie neutrofili można dostosować do potrzeb eksperymentalnych użytkownika. Neutrofile zostały ponownie zawieszone w końcowym stężeniu 4 x 10⁶ komórek/ml dla wszystkich eksperymentów opisanych poniżej. Aby uwzględnić zmienność między dawcami, zdecydowanie zaleca się, aby wszystkie eksperymenty związane z neutrofilami były przeprowadzane z udziałem co najmniej trzech różnych dawców.

3. Obrazowanie interakcji biofilm-neutrofile

1. Stwórz biofilm, wykonując kroki 1.2-1.6. Aby ułatwić obrazowanie biofilmu, należy zastosować fluorescencyjny szczep S. aureus, taki jak USA300 z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP), aby zwiększyć łatwość obrazowania mikroskopowego.
   nuta: Zamiast płytki 96-dołkowej użyto 6-μ-kanałowego szkiełka (patrz tabela materiałów) w celu zademonstrowania modelu biofilmu in vitro (krok 1).
2. Inkubować 4 x 10⁶ komórek/ml neutrofili ze 100 μM niebieskiego barwnika CMAC (7-amino-4-chlorometylokoumaryny) (BCD, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło w pozostałych etapach.
3. Aby wypłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile o stężeniu 270 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. W tym momencie dodać homodimer-1 etydyny (patrz tabela materiałów) do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 μM w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.
4. Dodać 150 μl neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na μ-szkiełkach, tak aby stosunek neutrofili do bakterii wynosił 1:30 (neutrofile: bakterie). Inkubować μ szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych opiera się na liczbie komórek uzyskanej z posiewu biofilmu trwającego 18 godzin.
5. Zobrazuj oddziaływanie neutrofile-biofilm za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników/białek fluorescencyjnych.
   nuta: W niniejszym badaniu BCD wynosi 353/466 nm, homodimer-1 etydyny-1 wynosi 528/617 nm, a GFP wynosi 395/509 nm. Ogranicz ekspozycję próbki na działanie lasera lub światła, aby zapobiec fotowybielaniu próbek.
6. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych lub programów, takich jak FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ i BAIT, między innymi.
   nuta: Podczas pracy z plamami należy wziąć pod uwagę specyfikę używanych barwników. Niektóre plamy działają na komórki prokariotyczne i eukariotyczne, podczas gdy inne działają tylko na jedną. Jeśli neutrofile i biofilmy są barwione oddzielnie przy użyciu barwników, które mogą barwić oba typy komórek, upewnij się, że zmyłeś pozostały barwnik przed połączeniem neutrofili i biofilmów, aby zapobiec barwieniu krzyżowemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nawadnianie 0,9% chlorkiem sodu, USP	Baxter	Numer katalogowy: 2F7124	Nie zawiera endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
Jednostka filtrująca o szybkim przepływie 150 ml	Thermo Scientific	565-0020
200-procentowy etanol	Firma VWR	89125-188
Strzykawka 3 ml	Bd	309657	Służy do pobierania krwi
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Thermo Scientific	339652
Strzykawka 60 ml	Bd	309653	Służy do pobierania krwi
agar	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP1423-2
Wacik nasączony alkoholem	Bd		Służy do pobierania krwi
Plastry			Służy do pobierania krwi
BD Bacto Tryptyczny bulion sojowy	Bd	DF0370-07-5	Połącz z 1,5% agarem, aby uzyskać agar sojowy Tryptic
Licznik komórek	Bal Saupply	Zobacz materiał 202C
CellTracker niebieski CMCH	Invitrogen	Zobacz materiał C2111	Niebieski barwnik CMAC (BCD)
Przezroczyste 96-dołkowe płyty polistyrenowe z płaskim dnem	Costar	3370
Gaza bawełniana	Marka rybacka	13-761-52	Służy do pobierania krwi
Probówki hodowlane	Marka rybacka	14-961-27	Szkło borokrzemianowe 13 x 100 mm
D-(+)-glukoza	Sigma	G-8270
Dekstran z Leuconostoc spp.	Sigma	31392-250G	Służy do izolacji neutrofili
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco 1x	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque plus	Cytiva (Cytiwa)	17144003	Służy do izolacji neutrofili (ośrodek o gradiencie gęstości)
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej
Hemocytometr	Jasna linia
heparyna	Novaplus (Nowy)	NDC 63323-540-57	1000 jednostek USP / ml, używany do pobierania krwi
IMARIS 9.8	Instrumenty oksfordzkie		Oprogramowanie do analizy obrazu mikroskopowego
Minimalna ilość niezbędnych nośników (MEM) Alpha 1x	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 41061-029
Igła (23 G1)	Bd	305145	Służy do pobierania krwi
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
Elementy NIS	Nikon		Oznaczanie ilościowe martwych neutrofili
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma	Zobacz materiał P4707-50ML
chlorek sodu	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP358-10	Służy do izolacji neutrofili
Sterylna woda do nawadniania, USP	Baxter	Numer katalogowy: 2F7114	Nie zawiera endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
Zestaw do infuzji ze skrzydełkami Surflo	Terumo (Ziemia)	SC*19BLK	19 G x 3/4", używany do pobierania krwi
Niebieska plama trypanowa (0,4%)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15250-061
Turnik			Służy do pobierania krwi
Woda destylowana UltraPure	Invitrogen	10977015
Białe, nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe	sokół	353296	Hodowla tkankowa poddana obróbce i płaska płyta denna
μ-Slide VI 0,4	Ibidi	Numer katalogowy 80601	Prowadnica μ-kanałowa