1. Przygotowanie biofilmu in vitro
- Uzyskać izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego materiału przy użyciu techniki smugowej płytki na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak agar sojowy tryptyczny (patrz tabela materiałów).
- Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnymH2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
nuta: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
- Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
- Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD600nm) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę środkowologarytmiczną do OD600nm wynoszącego 0,1.
- Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
nuta: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak μ-kanałowe szkiełka (patrz tabela materiałów).
- Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
nuta: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas płukania, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
- Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
nuta: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili .
2. Izolacja neutrofili
UWAGA: Neutrofile zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi zmianami. Ten protokół izolacji łączy najpierw wirowanie w gradionym gradiacji gęstości, a następnie 3% sedymentację dekstranu. W tej sekcji omówiono tylko ogólny protokół izolacji neutrofili, koncentrując się na zmianach wprowadzonych do opublikowanego protokołu. Co więcej, opisany poniżej protokół jest jedną z wielu metod, które mogą izolować neutrofile i mogą być zastąpione w razie potrzeby. Inne metody izolowania neutrofili obejmują użycie pożywek do separacji komórek lub magnetycznej separacji komórek przeciwciał.
- Pobrać krew od dorosłego dawcy poprzez wkłucie żyły, zgodnie z protokołem przedstawionym w instytucjonalnym IRB. Przed pobraniem krwi należy upewnić się, że w strzykawce znajduje się wystarczająca ilość heparyny wolnej od konserwantów, tak aby końcowe stężenie heparyny wynosiło 20 j./ml.
- Rozcieńczyć krew heparynizowaną 3/4 objętości 0,9% NaCl wolnego od endotoksyn (patrz tabela materiałów) w H2O w temperaturze pokojowej.
- Na każde 20 ml rozcieńczonej próbki krwi należy dodać 14 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce o gradiencie gęstości.
- Odwirować warstwową próbkę krwi o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka ma powolną przerwę, aby uniknąć naruszenia warstwy po zakończeniu wirowania.
nuta: Próbka krwi będzie miała pięć warstw zawierających mieszaninę soli fizjologicznej i osocza, warstwę komórek jednojądrzastych, pożywkę gradientu gęstości, neutrofile i erytrocyty.
- Za pomocą pipety serologicznej odessać wszystkie warstwy powyżej neutrofili i osadu erytrocytów, a następnie delikatnie zawiesić osad w zimnym, wolnym od endotoksyn 0,9% NaCl wH2O. Dla każdej osadki wytworzonej z 20 ml próbki krwi należy ponownie zawiesić osad z powrotem do całkowitej objętości 20 ml. Dodać 3% dekstranu w stosunku 1:1 (patrz Tabela Materiałów). Inkubować probówkę w pozycji pionowej przez 18-20 minut na lodzie.
nuta: Upewnij się, że 3% dekstran jest wykonany z wolnego od endotoksyn 0,9% NaCl w H2O.
- Usunąć 20 ml górnej warstwy zawierającej neutrofile i niektóre erytrocyty na nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 355 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odleć supernatant, pozostawiając czerwoną osadkę.
- Delikatnie zawiesić osad w 10 ml zimnego, sterylnegoH2Ona 30 sekund w celu lizy pozostałych erytrocytów. Natychmiast dodaj 10 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn do mieszaniny, aby przywrócić toniczność. Odwirować roztwór o stężeniu 233 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający 95%-97% neutrofili w 1 ml zimnego HBSS na 20 ml próbki krwi.
- Przenieść 10 μl zawieszonych neutrofili w 90 μl 0,4% barwnika wykluczającego błękit trypanowy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).
nuta: Komórki niezdolne do życia są barwione na niebiesko, ponieważ barwnik wykluczający błękit trypanowy jest nieprzepuszczalny w komórkach żywotnych. Protokół ten zapewnia >99% żywotności komórek.
- Dodać dodatkowe HBSS tak, aby końcowe stężenie neutrofili wynosiło 4 x 106 komórek/ml.
nuta: W przypadku <99% żywotności komórek nadal można osiągnąć końcowe stężenie 4 x 106 komórek/ml; jednak całkowita objętość roztworu zawierającego 4 x 106 komórek/ml uzyskana zmniejszy się. Końcowe stężenie neutrofili można dostosować do potrzeb eksperymentalnych użytkownika. Neutrofile zostały ponownie zawieszone w końcowym stężeniu 4 x 106 komórek/ml dla wszystkich eksperymentów opisanych poniżej. Aby uwzględnić zmienność między dawcami, zdecydowanie zaleca się, aby wszystkie eksperymenty związane z neutrofilami były przeprowadzane z udziałem co najmniej trzech różnych dawców.
3. Obrazowanie interakcji biofilm-neutrofile
- Stwórz biofilm, wykonując kroki 1.2-1.6. Aby ułatwić obrazowanie biofilmu, należy zastosować fluorescencyjny szczep S. aureus, taki jak USA300 z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP), aby zwiększyć łatwość obrazowania mikroskopowego.
nuta: Zamiast płytki 96-dołkowej użyto 6-μ-kanałowego szkiełka (patrz tabela materiałów) w celu zademonstrowania modelu biofilmu in vitro (krok 1).
- Inkubować 4 x 106 komórek/ml neutrofili ze 100 μM niebieskiego barwnika CMAC (7-amino-4-chlorometylokoumaryny) (BCD, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło w pozostałych etapach.
- Aby wypłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile o stężeniu 270 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. W tym momencie dodać homodimer-1 etydyny (patrz tabela materiałów) do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 μM w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.
- Dodać 150 μl neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na μ-szkiełkach, tak aby stosunek neutrofili do bakterii wynosił 1:30 (neutrofile: bakterie). Inkubować μ szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych opiera się na liczbie komórek uzyskanej z posiewu biofilmu trwającego 18 godzin.
- Zobrazuj oddziaływanie neutrofile-biofilm za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników/białek fluorescencyjnych.
nuta: W niniejszym badaniu BCD wynosi 353/466 nm, homodimer-1 etydyny-1 wynosi 528/617 nm, a GFP wynosi 395/509 nm. Ogranicz ekspozycję próbki na działanie lasera lub światła, aby zapobiec fotowybielaniu próbek.
- Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych lub programów, takich jak FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ i BAIT, między innymi.
nuta: Podczas pracy z plamami należy wziąć pod uwagę specyfikę używanych barwników. Niektóre plamy działają na komórki prokariotyczne i eukariotyczne, podczas gdy inne działają tylko na jedną. Jeśli neutrofile i biofilmy są barwione oddzielnie przy użyciu barwników, które mogą barwić oba typy komórek, upewnij się, że zmyłeś pozostały barwnik przed połączeniem neutrofili i biofilmów, aby zapobiec barwieniu krzyżowemu.
