Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy i DSS
- Myszy z nokautem (α-gustducin-/-) i myszy C57BL/6 α C57BL/6 z dopasowanym wiekiem, płcią i masą ciała należy przechowywać indywidualnie w czystych klatkach.
nuta: Myszy z nokautem były krzyżowane wstecznie z myszami C57BL / 6 przez ponad 20 pokoleń i mają prawie 100% tła genetycznego C57BL / 6.
- Rozpuścić 30 g sproszkowanego siarczanu dekstranu (DSS) w 1 l wody w autoklawie. Mieszać, aż roztwór stanie się klarowny, aby upewnić się, że końcowe stężenie robocze wynosi 3% (w/v).
nuta: Roztwór DSS można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 tygodnia lub w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Indukcja i ocena zapalenia jelita grubego DSS u myszy
- Zważ i zapisz początkową masę ciała każdej myszy. Umieść myszy pojedynczo w standardowych plastikowych klatkach i oznacz klatki.
- Zastąp zwykłą wodę pitną 3% roztworem DSS na łącznie 7 dni, do których obie grupy myszy mają dostęp ad libitum.
- Zmierz masę ciała myszy, rejestruj spożycie roztworu DSS oraz zbieraj i badaj stolec każdej myszy codziennie podczas podawania DSS. Obserwuj nasilenie biegunki i krwawienia z odbytu i przelicz je na wskaźnik choroby wywołany przez DSS.
- Podczas eksperymentu oblicza się procentową utratę masy ciała w porównaniu z masą początkową oraz wskaźnik choroby w celu oceny objawów zapalenia jelita grubego.
nuta: Wskaźnik choroby jest oceniany przez połączenie obserwacji biegunki i krwawienia z odbytu i jest zdefiniowany w następujący sposób: 0 (normalny stolec, brak krwi), 1 (miękki stolec, brak krwi), 2 (miękki stolec, mała ilość krwi), 3 (bardzo miękki stolec, umiarkowane krwawienie) i 4 (wodnisty stolec, znaczne krwawienie). Indeks chorób jest analizowany codziennie dla każdej myszy.
- Pod koniec 7-dniowej kuracji DSS należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy i kontynuować pozostałe eksperymenty.
3. Przygotowanie próbek tkanek
- Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Wykonaj nacięcie linii środkowej w jamie brzusznej o długości 3 cm za pomocą małych nożyczek, aby odsłonić jamę brzuszną.
- Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić śledzionę od innych tkanek, a następnie usuń śledzionę i zmierz jej rozmiar.
- Zidentyfikuj i podnieś okrężnicę za pomocą kleszczy i oddziel ją od otaczającej krezki. Wyciągnij całą okrężnicę, aż będzie widoczne jelito ślepe i odbytnica.
- Odizoluj okrężnicę, przecinając ją na brzegu okrężnicy i głęboko w miednicy, aby uwolnić odpowiednio okrężnicę proksymalną i dystalną. Następnie zmierz i zapisz długość izolowanej okrężnicy. Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki okrężnicy podczas zabiegu preparowania.
- Przepłukać okrężnicę 10 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłębnik w celu usunięcia kału i krwi, aż eluat będzie całkowicie czysty.
- W celu identyfikacji histologicznej podziel próbki tkanek równo na trzy części: proksymalną, środkową i dystalną. Następnie utrwalić tkankę 4% paraformaldehydem (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
- W celu analizy ekspresji cytokin należy szybko zamrozić całą okrężnicę ciekłym azotem i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
4. Histologiczna ocena nasilenia zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS
- Immunohistochemia
- Po utrwaleniu zanurz tkankę w roztworze 30% sacharozy w 1x PBS na noc w probówce o pojemności 15 ml w celu krioochrony próbek.
- Osadź tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i umieść ją w temperaturze -20 °C, aż OCT stwardnieje.
- Przenieś blok OCT zawierający tkankę do kriostatu, ustaw pokrętło grubości w kriostacie na 12 μm, a następnie pokrój i zbierz zamrożone skrawki o grubości 12 μm.
- Podgrzewać pobrane skrawki tkanek z kriostatu w temperaturze 65 °C przez 20 minut na gorącej płycie. Umyj sekcje w 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubuj skrawki tkanki w 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut, aby wyeliminować endogenną peroksydazę. Umyj sekcje jeszcze 3 razy. Zablokuj tkanki buforem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,3% niejonowego detergentu, 2% surowicy koziej, 0,1% azydku sodu w 1x PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub dłużej.
- Zastąp bufor blokujący roztworem zawierającym następujące podstawowe przeciwciała specyficzne dla typu komórek odpornościowych: CD45 dla leukocytów, CD3 dla limfocytów T, B220 dla komórek B, CD11b dla makrofagów i Ly6G dla neutrofili. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Usunąć pierwotne przeciwciała z wycinków tkanki przez aspirację. Umyj sekcje 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubować skrawki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym, a następnie inkubować z kompleksem streptawidyna-HRP w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki z roztworem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), aby uzyskać jasno- lub ciemnobrązowy kolor i uwidocznić komórki immunoreaktywne.
- Przeciwbarwić skrawki hematoksyliną i rozcieńczonym 0,3% (v/v) amoniakiem. Rób zdjęcia w jasnym polu przy 10-krotnym powiększeniu pod mikroskopem.
- Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby zidentyfikować i określić ilościowo populację oznaczonych komórek odpornościowych zarówno w nabłonku, jak i blaszce właściwej (pod nabłonkiem), ustawiając 2 maski: użyj pierwszej maski w funkcji opartej na kostce kolorów, aby ustawić próg wykrywania koloru i zmierz kolorowe obszary reagujące na DAB; użyj drugiej maski, aby określić całkowite obszary nabłonka i laminarnej właściwości w badanym przekroju. Wyraź populację komórek immunoreaktywnych jako stosunek powierzchni barwienia naciekanych komórek do całkowitej powierzchni badanej tkanki.
