Zabijanie komórek K562 przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wystawione na działanie preparatów wyrobów tytoniowych

Streszczenie

Źródło: Arimilli, S. et al., Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie badamy wpływ całego medium kondycjonowanego dymem, preparatu palnego tytoniu, na zabijanie komórek K562 przez efektorowe komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.

Protokół

1. Test zabijania K562

UWAGA: Komórki K562 powinny być hodowane w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ z kompletną pożywką RPMI, aż osiągną 80% konfluencji przed testem.

1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), dodając do fiolki 18 μl DMSO.
2. Rozcieńczyć WS-CM lub nikotynę w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę, aby osiągnąć pożądane jednostki ekwitosyny nikotyny lub stężenia nikotyny dla każdej studzienki.
   ostrożność: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
3. Dodać 100 μl PBMC do kompletnej pożywki RPMI o stężeniu 1,5 x 10⁶ komórek/dołek. Całkowita objętość komórek z WS-CM lub nikotyną wyniesie 200 μl/studzienkę.
4. Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Przemyć komórki K562 dodając 10 ml DPBS i odwirować przy 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml DPBS i policzyć komórki K562.
7. Przygotować roztwór roboczy CFSE, dodając 1 μl roztworu podstawowego CFSE do 1 ml DPBS.
8. Dodać 1 ml roztworu roboczego CFSE do 1 ml zawiesiny komórek K562 zawierającej 1-2 x^10,7 komórek. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Natychmiast dodaj 200 μl FBS. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
10. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI i odwirować probówkę o sile 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
11. Usuń supernatant RPMI, rozbij osad i ponownie zawieś komórki za pomocą 10 ml kompletnego podłoża RPMI i policz komórki K562 znakowane CFSE.
12. Przemyć PBMC przez odwirowanie płytki o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant przez dekantację cieczy. Załóż pokrywę i przekręć spód płyty. Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI i powtórzyć etap prania jeszcze raz.
13. Dodać komórki K562 znakowane CFSE w stosunku 1:15 (100 000 K562s: 1,5 x 10⁶ PBMC) do każdej studzienki próbki na płytce PBMC i dalej inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
14. Przemyć mieszaninę komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant odrzucając płyn. Załóż pokrywę i przekręć spód talerza.
15. Dodać 200 μl bieżącego buforu i powtórzyć krok mycia opisany w kroku 14 jeszcze raz.
16. Dodać 95 μl buforu bieżącego, a następnie 5 μl 7AAD do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl/studzienkę. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
17. Dodać 100 μl buforu do każdej studzienki i przenieść całą objętość zawiesiny komórek z każdej studzienki płytki do probówek zbiorczych i pobrać próbki na cytometrze przepływowym.
18. Określ procent komórek 7AAD-dodatnich i CFSE za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12 x 75 tub	BD Sokół	352058
Probówki stożkowe 15 ml	Corning	Numer telefonu 430790
2 ml mikroprobówek	Axygen (Axigen	MCT-150-C-S
Probówki stożkowe 50 ml	Corning	430828
Butelka 500 ml	Corning	430282
7AAD powiedział:	BD Pharmingen	559925
96-dołkowa płaska płyta dolna	Termo Nunc	439454
96-dołkowe okrągłe płyty dolne	BD Sokół	353077
Kaptur do hodowli komórkowych	Thermo Scientific	Seria 1300 A2
wirówka	Eppendorf	58110R
Międzynarodowa Federacja Piłki	Sondy molekularne Technologie życia	Zobacz materiał C34554
Rurki klastrowe	Corning	Numer katalogowy: 4401	Działa szkodliwie po połknięciu, jest rakotwórczy
DMSO (sulfotlenek dimetylu)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Lonza	17-512F
FBS (Sieć Usługowa	Sigma-Aldrich	F2442
Jednostka filtrująca	Nalgene powiedział:	156-4020
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne	FACS Canto II	8 kolorów przy Ex 405 nm i Em785 nm.
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne	FACS Calibur	4 kolory przy Ex 495 nm i Em 785 nm.
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	Gwiazda drzewa	FlowJo
nikotyna	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy N3876	Toksyczność ostra, Zagrożenie dla środowiska
Parafilm	Bemis	"M"
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6148	Łatwopalny, Działanie drażniące na skórę
Pióro/paciorkowiec	Technologie życiowe Gibco	Rozdział 15140-122
Silnik RPMI 1640	Technologie życiowe Gibco	Numer katalogowy 11875-093
Uruchomiony bufor	Bufor do biegania MACS, Miltenyi Biotech	130-091-221
Pipeta transferowa	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-711-20
Baza Tris	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T1503

) powiedział: T Klienta powiedział: powiedział: