1. Przygotuj syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2)
UWAGA: Przygotowanie SCFM2 składa się z trzech głównych etapów opisanych poniżej (Rysunek 1).
- Sterylizacja mucyny wieprzowej
- Przygotować sterylną mucynę w końcowym stężeniu 5 mg/ml w SCFM2. Na przykład, aby uzyskać objętość 5 ml SCFM2, zważ 25 mg mucyny typu II na sterylnej szalce Petriego i umieść ją w sterylizatorze ultrafioletowym (UV) na 4 godziny, delikatnie mieszając co godzinę.
- Po 4 godzinach przenieść mucynę poddaną działaniu promieniowania UV do autoklawowanych probówek o pojemności 1,7 ml w sterylnych warunkach i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Aby potwierdzić całkowitą sterylizację, rozpuść próbkę mucyny w sterylnym płynie, takim jak woda lub bulion Luria-Bertani (LB) i obserwuj pod mikroskopem.
nuta: Wysterylizowany mucyna może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Przygotowanie buforowanej bazy
- Przygotować roztwory podstawowe soli i aminokwasów, dodając odpowiednie ilości wagowo do wody dejonizowanej, jak podano w Tabeli 1. Przefiltruj i wysterylizuj wszystkie roztwory podstawowe za pomocą filtra 0,22 μm, zawiń w folię w celu ochrony przed degradacją światła i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
- Przygotować buforowaną zasadę, łącząc 190 ml wody dejonizowanej z podstawowymi roztworami aminokwasów i soli o objętościach podanych w tabeli 1. Doprowadzić roztwór do pH 6,8 i zwiększyć do końcowej objętości 250 ml. Sterylizować filtrem za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 dni.
- Wieczorem przed eksperymentem podwielokrotnić pożądaną ilość buforowanej zasady do szklanej kolby hodowlanej i dodać mucynę (5 mg/ml, jak opisano w kroku 1.1.1) i oczyszczone DNA plemników łososia (0,6 mg/ml). Delikatnie wymieszać, zawinąć w folię i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C, aby mucyna i DNA mogły rozpuścić się w roztworze.
nuta: Podwielokrotności DNA plemników łososia należy rozmrozić na lodzie, zawirować i dodać do buforowanej zasady i mucyny. Roztwory podstawowe tryptofanu, asparaginy i tyrozyny muszą być przygotowywane w roztworach NaOH (patrz tabela 1 dla stężeń) zamiast w wodzie dejonizowanej. Przechowywać buforowaną bazę i wszystkie roztwory podstawowe owinięte w folię w celu ochrony przed światłem. Większość zapasów będzie stabilna przez okres do miesiąca. Zapasy, które się odbarwiają, nie powinny być używane i należy je wymienić przed użyciem.
- Dodanie zapasów uzupełniających
- W dniu doświadczenia dodać zapasy wymienione w tabeli 2 do buforowanej zasady zawierającej mucynę i DNA.
nuta: Przygotować świeży roztwórFeSO4 w dniu doświadczenia, ale wszystkie inne zapasy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać przez 30 dni w temperaturze 4 °C. 1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) zawiera chloroform. Obchodź się z nim ostrożnie i nie używaj w pobliżu otwartego ognia. Po dodaniu DOPC inkubować SCFM2 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min) przez co najmniej 20 minut (dla 5 ml hodowli). Ten okres inkubacji pozwala na odparowanie chloroformu w DOPC. Kolba nie powinna być szczelna; Zamiast tego przykryć luźno otwór kolby folią.
2. Ocena tolerancji na środki przeciwdrobnoustrojowe w agregatach bakteryjnych
w czasie rzeczywistym
- Przygotuj kultury na noc
- Wieczorem przed eksperymentem zaszczepić 5 ml bulionu LB kilkoma koloniami Pa PAO1-pMRP9-113 z płytki agarowej LB zawierającej antybiotyk (karbenicylina 300 μg/ml). Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 250 obr./min.
nuta: Hoduj kultury nocne z dodatkiem antybiotyków wymaganych do wyboru wymaganych plazmidów (w tym przypadku plazmid ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP), pMRP9-1). Należy pamiętać, że komórki Pa należy umyć przed inokulacją SCFM2. LB może być zastąpiony innymi bogatymi pożywkami laboratoryjnymi do hodowli nocnych. Wszystkie izolaty bakteryjne powinny być traktowane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi BSL-2 w całym tym protokole.
- Zaszczepienie SCFM2
- W dniu eksperymentu należy rozcieńczyć wstecznie nocne kultury Pa 1:10 (hodowla: płynna pożywka) poprzez zaszczepienie 500 μl w 5 ml świeżego bulionu LB. Hodować komórki do fazy logarytmicznej (60-90 min) w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 250 obr./min.
- Odwirować kultury w fazie logarytmicznej przy 10 000 × g przez 5 minut. Przemyć komórki, usuwając supernatant i ponownie zawieszając je w 3 ml sterylizowanego filtrem roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS, pH 7,0). Powtórzyć czynność dwukrotnie i ponownie zawiesić osad w końcowej objętości 1 ml PBS.
- Zmierzyć absorbancję przemytych komórek za pomocą spektrofotometru przy długości fali 600 nm (OD600) i obliczyć objętość kultury wymaganą do uzyskania wyjściowego OD600 wynoszącego 0,05 w 5 ml SCFM2. Zaszczepij Pa w SCFM2 i delikatnie wiruj, aby rozprowadzić komórki w całym tekście. Odpipetować 1 ml zaszczepionego SCFM2 do każdej komory 4-dołkowej czaszy optycznej ze szklanym dnem i inkubować przez 4 godziny statycznie w temperaturze 37 °C.
nuta: Czas podwajania kultur Pa zależy od szczepu i dostępności tlenu. W SCFM2, w opisanych tu warunkach, czas podwojenia Pa wynosi ~1,4 h.
3. Wizualizacja agregatów podczas antybiotykoterapii za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM)
UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i oprogramowania do przechwytywania obrazów do obrazowania agregatów Pa w SCFM2. Celem jest obserwacja i charakterystyka pozostałej (tolerancyjnej) biomasy bakteryjnej po leczeniu antybiotykami. Opisane czynności można z powodzeniem wykonać na innych mikroskopach konfokalnych, chociaż należy zapoznać się z instrukcją obsługi przyrządu w celu uzyskania szczegółowych wskazówek.
- Obrazować kultury Pa przy użyciu ogrzewanej komory lub podgrzewanej mikropłytki umieszczonej na stoliku mikroskopu w celu utrzymania temperatury otoczenia 37 °C. Uruchomić moduł inkubacyjny co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić całej aparaturze osiągnięcie żądanej temperatury i zmniejszyć dalsze rozszerzanie i ruchy podczas zbierania danych.
- Po 4 godzinach przenieść kultury SCFM2 zawierające komórki Pa do podgrzanego stolika mikroskopowego. Oznacz 3 z 4 studzienek jako kontrpróby techniczne do leczenia antybiotykami i rozważ czwartą studzienkę jako kontrolę bez leczenia, zawierającą tylko komórki Pa w SCFM2, bez antybiotyków. Zidentyfikuj agregaty za pomocą mikroskopii jasnego pola na karcie Lokalizacja przed jakimkolwiek wzbudzeniem reporterów fluorescencyjnych. Zdefiniuj obszar do obrazowania w każdym dołku i zapisz jego położenie (współrzędne x-y-z) za pomocą modułu Pozycje w oprogramowaniu do obrazowania.
- Użyj 63-krotnego obiektywu zanurzonego w oleju, aby uwidocznić kultury Pa zawierające plazmid ekspresji GFP pMRP9-1 w SCFM2 o długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 509 nm. Rób zdjęcia za pomocą opcji z-stack w module Akwizycja w odstępach 1 μm (łącznie 60 warstw). Użyj modułu uśredniania linii, aby zredukować fluorescencję tła w kanale GFP w całkowitej objętości obrazów z-stack 60 μm (1 093,5 mm3). Wykonaj obrazy kontrolne niezaszczepionego SCFM2, używając identycznych ustawień, aby określić fluorescencję tła do analizy obrazu.
nuta: Obrazy są uzyskiwane poprzez tworzenie 8-bitowych obrazów stosu nakrywkowego o wymiarach 512 x 512 pikseli (0,26 μm x 0,26 μm pikseli), które znajdują się w odległości 60 μm od podstawy szkiełka nakrywkowego.
- Użyj opcji szeregów czasowych w oprogramowaniu do obrazowania, aby uchwycić 60 wycinków w każdej pozycji (dołku) w 15-minutowych odstępach przez okres 18 godzin. Użyj określonej strategii ostrości w oprogramowaniu, aby zapisać płaszczyznę ogniskową dla każdej pozycji, do której powraca w każdym punkcie czasowym podczas eksperymentu.
- Po całkowitych 4,5 godzinach inkubacji zobrazuj każdą pozycję, korzystając z powyższych ustawień, aby określić zagregowaną biomasę w każdym z czterech dołków przed dodaniem antybiotyku.
- Po 6 godzinach całkowitej inkubacji dodać antybiotyk o stężeniu 2 razy niższym od minimalnego stężenia hamującego (MIC) do każdej kontrpróby. Pipetować bezpośrednio i delikatnie do środka studzienki, tuż poniżej interfazy powietrze-ciecz. Utrzymuj wszystkie kultury w ogrzewanej komorze konfokalnej.
nuta: Zastosowano siarczan kolistyny w stężeniu 140 μg/ml.
- Rozpocznij obrazowanie po antybiotykoterapii, klikając opcję Rozpocznij eksperyment w programie do obrazowania.
nuta: Stężenie zastosowanego antybiotyku zależy od antybiotyku, izolatu Pa oraz od tego, czy użytkownik chciałby zbadać efekt zabijania lub tolerancji. W tym eksperymencie stosuje się pojedynczą dawkę. W razie potrzeby można dodać dodatkowe dawki bez zakłócania kultur.
4. Barwienie agregatów Pa jodkiem propidyny
UWAGA: Jodek propidyny (PI) jest powszechnie używany jako odczynnik barwiący do identyfikacji niezdolnych do życia (martwych) komórek bakteryjnych w hodowli. W tym przypadku służy do identyfikacji agregatów wrażliwych na antybiotykoterapię zastosowaną w punkcie 3. W całym tym protokole ekspresja i wykrywanie GFP w komórkach Pa jest wykorzystywane jako główny wskaźnik żywotności komórek. Ten ostatni krok pozwala na ponowne zastosowanie obrazowania konfokalnego w celu określenia przestrzennego położenia żywych/martwych agregatów względem siebie. Ponadto agregaty są identyfikowane jako żywe/martwe w celu dalszego sortowania komórek w sekcji 3.
- Po 18 godzinach dodać PI do każdej studzienki czterokomorowej optycznej płytki dennej zawierającej kultury SCFM2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi objętości PI i czasu inkubacji (np. ~2 μL na ml kultury, ~20-30 min).
5. Izolowanie żywych komórek od agregatów przy użyciu metody sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
UWAGA: FACS prezentuje potężną platformę do sortowania i izolowania grup komórek według fluorescencyjnie oznaczonego fenotypu. W tym przypadku FACS służy do izolowania żywych (odpornych na antybiotyki) agregatów od agregatów nieżywotnych.
- Po zabarwieniu jodkiem propidyny usunąć kultury z inkubacji i przenieść do instrumentu FACS w izolowanym pojemniku w celu utrzymania temperatury 37 °C.
- Uruchomić 1 ml podwielokrotności SCFM2 zawierającego agregaty Pa przy najniższym natężeniu przepływu.
nuta: Każda porcja będzie zawierać ~15 000 agregacji.
- Aby wykryć GFP, należy oświetlić ogniwa laserem o długości fali 488 nm i zarejestrować wysokość sygnału fluorescencyjnego przy 530/30 nm. Wizualizacja barwienia PI przez wzbudzenie za pomocą lasera 561 nm i rejestracja wysokości sygnału fluorescencyjnego przy 610/20 nm. Sortowanie należy wykonywać za pomocą dyszy 70-u.
nuta: Posortowane agregacje można łączyć na wiele sposobów, w zależności od aplikacji użytkownika. W tym przypadku FACS wykorzystano do sortowania żywotnych agregatów Pa do sekwencjonowania RNA w dalszej kolejności.
Tabela 1: Przygotowanie zapasów soli, aminokwasów, DNA i mucyny wymaganych do buforowania bazy syntetycznej pożywki z plwociny mukowiscydozy, SCFM2.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
powiedział:
pkt.
pkt.
| chemiczny | Koncentracja zapasów (m) | Stężenie końcowe (mM) | Notatki |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | Wydanie orzeczenia 1,25 | |
| Zobaczmateriał KNO 3 | 1 | 0,35 | |
| K2SO4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | Pytanie 2,28 | Dodaj bryłę bezpośrednio do buforowanej podstawy |
| Kcl | | 14,94 | Dodaj bryłę bezpośrednio do buforowanej podstawy |
| Zawartość NaCl | | Klasa 51,85 | Dodaj bryłę bezpośrednio do buforowanej podstawy |
| Mopy | | 10 | Dodaj bryłę bezpośrednio do buforowanej podstawy |
| Ser | 0,1 | Godzina 1,45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| pro | 0,1 | 1,66 | |
| Gly powiedział: | 0,1 | Rozdział 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1,78 | |
| Val | 0,1 | Pytanie 1,12 | |
| Spełnione | 0,1 | 0,63 | |
| Ile | 0,1 | Pytanie 1,12 | |
| Mołdawski | 0,1 | Wynik 1,61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | Pytanie 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | Przygotowany w 0,2 M NaOH |
| Asp | 0,1 | 0,83 | Przygotowany w 0,5 M NaOH |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | Przygotowany w 1,0 M NaOH |
| Czterej | 0,1 | 1,07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Phe | 0,1 | 0,53 | |
| Jego HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| DNA plemników łososia | | 0,6 mg/ml | |
| Mucyna wieprzowa | | 5 mg/nL | |
Tabela 2: Przygotowanie dodatkowych zapasów wymaganych do buforowania bazy syntetycznej pożywki z plwociny mukowiscydozy, SCFM2.
pkt.
pkt.
| chemiczny | Koncentracja zapasów (M) | Stężenie końcowe (mM) | Notatki |
| Dekstroza (D-glukoza) | 1 | 3 | |
| Kwas L-mlekowy | 1 | 9,3 | Dostosuj do pH 7,0 za pomocą NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | Pytanie 1,75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/ml | 0,0036 | Codziennie rób świeże |
| N-acetyloglukozamina | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfokolina (DOPC) | 25 mg/ml | 100 μg/ml | Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze 37 °C po dodaniu |
