$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie komórek do infekcji
- Rozmnażać mysią linię komórkową podobną do makrofagów RAW 264.7 w pożywkach do hodowli tkankowych DMEM uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą (odtąd określaną jako DMEM/FCS) przy użyciu kolby o pojemności 125 ml i inkubatora do hodowli tkankowych utrzymywanego w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Dzień przed zakażeniem należy użyć skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z kolby rozprężnej i zebrać w stożkowej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant, zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/FCS (bez antybiotyków) i określić miano za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Dostosuj miano do 2 x 106 komórek/ml i dodaj 0,10 ml (2 x 105 komórek) do studzienek 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że zawiesina komórek pokrywa całą powierzchnię studzienki.
- Umieść komórki w dodatkowych studzienkach dla późniejszego źródła kondycjonowanych pożywek. Umieść również 0,10 ml DMEM / FCS w trzech dodatkowych studzienkach, aby służyły jako "kontrola bez komórek".
- Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Następnego dnia nie wyjmować z inkubatora, dopóki inokulum bakterii nie zostanie przygotowane i nie będzie gotowe do użycia.
2. Przygotowanie Listeria monocytogenes (Lm) do zakażenia
- Zaszczepić 2 ml naparu mózgowo-sercowego (BHI) pojedynczą kolonią ze świeżo pokrytej płytki agarowej (<2 dni) Lm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 130 obrotów/min.
- Następnego dnia dodać 0,10 ml kultury przez noc do 2 ml wstępnie ogrzanego BHI i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna (OD600) wyniesie od 0,4 do 0,6.
- Określ przybliżone miano bakterii za pomocą empirycznie uzyskanego wzoru konwersji. W naszym laboratorium wykładniczo rosnąca kultura Lm w BHI wynosi około 1,3 x 109 jednostek tworzących kolonie (CFU)/OD600. Zminimalizuj czas, w którym kultury bakterii są wystawione na działanie temperatury pokojowej.
- Tuż przed zakażeniem dostosować miano do 5 x 107 CFU/ml, używając wstępnie podgrzanego DMEM/FCS jako rozcieńczalnika.
3. Infekcja
- Pracując szybko i precyzyjnie, dodać 20 μl (1 x 106 CFU; wielokrotność infekcji, MOI = 5) świeżo przygotowanego inokulum Lm (krok 2.4 powyżej) do studzienek, lekko przechylając szalkę i ostrożnie umieszczając końcówkę pipety w leżącej pożywce;
UWAGA: Unikaj dotykania ścianek studzienki końcówką pipety.
- Delikatnie odpipetować zawartość każdej studzienki, aby zapewnić całkowite wymieszanie; nie potrząsać ani nie przechylać płytki znacząco, ponieważ spowoduje to rozprowadzenie Lm po ściankach studzienki. Umieścić naczynie do hodowli komórkowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Przygotować roztwór gentamycyny o stężeniu 10 μg/ml, używając kondycjonowanych pożywek z niezakażonych studzienek jako rozcieńczalnika.
- Po 30 minutach od zakażenia (mpi) ostrożnie dodać 30 μl roztworu gentamycyny (końcowe stężenie 2,5 μg/ml) i delikatnie odpipetować zawartość studzienki jak poprzednio, a następnie umieścić naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Przy 60 mpi należy zebrać odpowiednie dołki do testu CFU (punkt czasowy 60 mpi) lub analizy FCM (jak opisano poniżej odpowiednio w sekcjach 4 i 5).
- W przypadku pozostałych studzienek, w różnych momentach po ich zakończeniu, albo pobiera się komórki, jak poprzednio, albo, w przypadku testu wschodów Lm, całkowicie usuwa się pożywkę ze studzienki i zastępuje się ją 150 μl pożywki kondycjonowanej bez gentamycyny.
4. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych Lm za pomocą testu CFU
- Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie wyjmij całe podłoże ze studni. Dodać 0,50 ml destylowanej sterylnej wody (dsH2O) do studzienki. Po 30 s przenieś powstały lizat wodny (10:0) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i energicznie wiruj przez 10 s.
- Przygotować rozcieńczenia 10-1 i 10-2, dodając 4,5 μl lub 50 μl lizatu wodnego do 450 μl dsH2O i krótko przemieszać, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Rozprowadzić 50 μl 10 0, 10-1 i/lub 10-2 próbek na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB).
- Aby oznaczyć obecność Lm (krok 3.6 powyżej), należy usunąć 10 μl pożywki wierzchniej i podzielić ją na dwie podwielokrotności po 5 μl: do jednej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS, a do drugiej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS zawierającej 5 μg/ml gentamycyny. Ta ostatnia kontrola rozróżnia zewnątrzkomórkowy Lm (wrażliwy na gentamycynę) i wewnątrzkomórkowy Lm (odporny na gentamycynę) w kolejnym teście CFU.
- Po 5 minutach w temperaturze pokojowej dodać 90 μl dsH2O, energicznie wirować przez 10 s i rozprowadzić 50 μl na płytkach agarowych LB.
- Wymienić kolonie Lm na płytkach agarowych LB po 2 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C.