Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowych i pojawiających się zewnątrzkomórkowych Listeria monocytogenes in vitro

Streszczenie

Źródło: Gayle, P. et al., Używanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmu. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie określamy ilościowo wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes, wewnątrzkomórkową bakterię chorobotwórcze, po ich zakażeniu hodowanymi makrofagami in vitro za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych lm za pomocą cytometrii przepływowej (FCM)

1. Przygotować mysią linię komórkową podobną do makrofagów RAW 264.7 w pożywce do hodowli tkankowych DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (odtąd określaną jako DMEM/FCS) przy użyciu kolby o pojemności 125 ml i inkubatora do hodowli tkankowej utrzymywanego w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 .} Dostosuj komórki do 1 x 10⁶ komórek/ml i dodaj 1 ml (1 x 10⁶ komórek) do studzienek 6-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej.
2. Przygotować Listeria monocytogenes, Lm, inokulum bakterii i zainfekować komórki objętością inokulum odpowiadającą MOI 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. Po 1,5 godziny od zakażenia (hpi) zebrać pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i umieścić na lodzie, aż wszystkie studzienki zostaną przetworzone.
4. Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj 1 ml ds_{H 2}O do studzienki i po 60 s przenieś powstały lizat wody do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z 500 μl 4% PFA. Wiruj energicznie przez 10 sekund i umieść na lodzie, aż wszystkie dołki zostaną przetworzone.
5. W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp 1 ml DMEM/FCS 5 μg/ml gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkowy Lm i natychmiast zwrócić komórki do inkubatora.
6. Po 30 minutach (2 hpi) usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny.
7. Po 2 i 4 godzinach (4 i 6 hpi) należy wykonać drugi i trzeci punkt czasowy, pobierając pożywki i lizaty.
8. Probówki wirówkowe o stężeniu 10 000 x g przez 7 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.
9. Zawiesić każdą granulkę w koktajlu barwiącym zawierającym 50 μl 4% PFA i 15 μl falloidyny. Inkubować probówki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
10. Po inkubacji dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.
11. Wirować probówki o sile 10 000 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.
12. Zawiesić każdą osadkę w 400 μl buforu FACS do natychmiastowego użycia lub 200 μl buforu FACS i 200 μl 4% PFA, jeśli jest przechowywana do późniejszej analizy.
13. Uruchom próbki na cytometrii przepływowej i przeanalizuj zebrane dane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Sitko do komórek, 70 μm	Firma VWR	Numer katalogowy: 10199-656
Kolagenaza D	Roche	11088858001
Nośniki DMEM	Gibco (firma Gibco)	11965-092
Rury FACS	BD Sokół	352054
FBS - Inaktywowany termicznie	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Zrównoważony roztwór soli Hanksa	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
Agar LB	Hoduj komórki MS	MBPE-4040 (wersja angielska)
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtych plam martwych komórek	Technologie życiowe	L349S9
Rodamina falloidyna	Termo Fischer	Czynnik chłodniczy R415
Analizator spektralny SP6800	Sony
Płytki 48-dołkowe do hodowli tkankowej TPP	MIDSCI	TP92048
Płytki 6-dołkowe do hodowli tkankowej TPP	MIDSCI	TP92406