1. Zbieraj i przygotuj muchy
- Tylny Drosophila melanogaster w pożądanych warunkach eksperymentalnych. Należy uważać, aby nie przeludnić much podczas odchowu i upewnić się, że zagęszczenie larw jest spójne we wszystkich zabiegach, ponieważ warunki środowiskowe w stadium larwalnym mogą głęboko wpływać na fenotypy obrony immunologicznej w stadium dorosłym.
- Zebrać eksperymentalne muchy 0 - 3 dni po eklozji z puszki poczwarki i przenieść je na świeże podłoże.
- Zebrane muchy należy przechowywać w żądanej temperaturze (zazwyczaj odpowiednie są temperatury od 22 °C do 28 °C) do osiągnięcia wieku 5 - 7 dni po ekluzji.
nuta: Daje to muchom wystarczająco dużo czasu na zakończenie metamorfozy i osiągnięcie dojrzałych osobników dorosłych, ale jest to na długo przed rozpoczęciem starzenia.
- Przed zakażeniem należy posortować żądaną liczbę much do osobnej fiolki, ponownie uważając, aby uniknąć przepełnienia.
nuta: W tej demonstracji zarażane są tylko samce, ale równie możliwe jest zarażenie samic przy użyciu opisanej procedury.
2. Hodowla i przygotowanie bakterii
- Przygotuj płytkę wzorcową z wybranymi bakteriami co najmniej 2 dni przed zakażeniem. Usunąć bakterie z 15% glicerolu przechowywanego przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C. Płytkę wzorcową należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Płytki główne należy zawsze nakładać bezpośrednio z zamrożonego wywaru glicerynowego. Należy unikać seryjnego przechodzenia bakterii z płytki na płytkę, ponieważ powtarzające się przechodzenie w kulturze może spowodować ewolucję bakterii w osłabionej zjadliwości.
nuta: W tym przykładzie wykorzystano Providencia rettgeri i Escherichia coli.
- Należy postępować zgodnie z poniższą procedurą, aby przygotować zawiesinę bakteryjną do wstrzykiwań.
- Wyhodować 2 ml kultury bakterii, zaszczepiając sterylne podłoże pojedynczą kolonią wyizolowaną z płytki wzorcowej. Wyhodować bakterie do fazy stacjonarnej (np. wzrost O/N w temperaturze 37 °C).
nuta: Zarówno P. retggeri, jak i E. coli dobrze rosną w bulionie Luria w temperaturach od 20 do 37 °C z delikatnym wstrząsaniem.
- Gdy hodowla osiągnie fazę stacjonarną, delikatnie osadzić komórki z ok. 600 μl kultury w wirówce stołowej (3 min przy 5 000 x g), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić bakterie w ok. 1 000 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM chlorek sodu, NaCl, 2,7 mM chlorek potasu, KCl, 10 mM fosforan sodu, Na2PO4, 1,8 mM diwodorofosforan potasu, KH2PO4, pH = 7,4).
- Rozcieńczyć zawieszone komórki w sterylnym PBS w celu uzyskania gęstości optycznej (OD) odpowiedniej dla używanej bakterii, mierzonej za pomocą spektrofotometru jako absorbancji przy 600 nm. Użyj tej zawiesiny, aby zarazić muchy.
nuta: A600 = 0,1 lub 1,0 odpowiada odpowiednio około 10,8 i 10,9 Providencia rettgeri lub E. coli na ml. Ponieważ zarówno żywe, jak i martwe bakterie przyczyniają się do gęstości optycznej, ważne jest, aby zbierać kultury na wczesnym etapie stacjonarnym, zanim zwłoki bakteryjne zgromadzą się i zniekształcą związek między gęstością optyczną a liczbą żywych bakterii wprowadzonych podczas infekcji.
3. Zainfekuj muchy
UWAGA: Ponieważ na odporność Drosophila wpływa rytm okołodobowy, ważne jest, aby przeprowadzać infekcje o podobnej porze dnia w eksperymentalnych powtórzeniach.
- Korzystanie z nanowtryskiwacza
- Przygotuj szklane igły na infekcję.
- Przygotuj szklaną igłę, pociągając kapilarnę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet.
- Za pomocą kleszczy odłam końcówkę igły, aby utworzyć otwór o średnicy około 50 μm, aby umożliwić wyrzucenie płynu.
- Zamontuj wtryskiwacz.
- Umieść O-ring uszczelniający, a następnie białą przekładkę (duże wgłębienie skierowane na zewnątrz) na metalowym tłoku.
- Napełnić szklaną igłę olejem mineralnym za pomocą strzykawki z igłą 30 G.
- Przełóż wypełnioną szklaną igłę przez tuleję zaciskową, a następnie umieść większy O-ring wokół jej podstawy, około 1 mm od końca igły.
- Wsuń igłę na metalowy tłok i delikatnie przykręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna.
- Wyrzuć większość oleju mineralnego z wtryskiwacza, ale upewnij się, że w igle nadal znajduje się niewielka objętość oleju, która działa jako bariera między wstrzykiwaczem a zawiesiną bakteryjną. Upewnij się, że w zawiesinie oleju mineralnego lub bakteryjnej ani między tymi dwoma płynami nie ma pęcherzyków powietrza.
- Ustawić wtryskiwacz na żądaną objętość do wstrzyknięcia (od 9 nl do 50 nl).
- Generuj kontrolki zranień.
- Napełnij igłę iniektora sterylnym PBS, ostrożnie wkładając końcówkę igły kapilarnej do probówki z pożywką i naciskając przycisk "napełnij" na wtryskiwaczu.
nuta: Sterylne bakteryjne podłoża wzrostowe mogą być również używane jako kontrola ran, jeśli eksperyment wymaga wstrzyknięcia bakterii zawieszonych w ich pożywce wzrostowej. Ponieważ jednak pożywka bakteryjna zawiera składniki, które mogą stymulować układ odpornościowy lub mieć inny wpływ na gospodarza, preferowany jest obojętny nośnik, taki jak PBS.
- Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem dwutlenku węgla (CO2 ).
- Wstrzyknąć muchy w przednią część brzucha na brzuszno-boczną powierzchnię za pomocą sterylnego PBS.
nuta: Możliwe jest również wstrzykiwanie much w inne miejsca, takie jak płytka mostkowo-opłucnowa klatki piersiowej, ale ważne jest, aby miejsce wstrzyknięcia było spójne w każdym eksperymencie.
- Umieścić wstrzyknięte muchy w świeżych fiolkach z nowym podłożem, kładąc fiolki na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.
nuta: Zaleca się wstrzyknięcie muszek kontrolnych PBS przed wstrzyknięciem bakterii do muszek doświadczalnych, tak aby ta sama igła mogła być użyta do obu zabiegów. Nie zawsze będzie możliwe użycie tej samej igły do całego eksperymentu. W takim przypadku pożądane może być odnotowanie, która igła została użyta z którymi muchami i uwzględnienie tożsamości igły jako czynnika eksperymentalnego w analizie statystycznej.
- Wstrzyknij patogen bakteryjny.
- Wysunąć pozostałą sterylną pożywkę z wstrzykiwacza i ponownie napełnić tę samą igłę zawiesiną bakteryjną.
- Powtórzyć powyższą procedurę (3.1.3), teraz wstrzykując muszkom zawiesinę bakteryjną przygotowaną w procedurze 2.2.
