$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Zbieraj i przygotuj muchy
- Tylny D. melanogaster w pożądanych warunkach doświadczalnych. Należy uważać, aby nie przeludnić much podczas odchowu i upewnić się, że zagęszczenie larw jest spójne we wszystkich zabiegach, ponieważ warunki środowiskowe w stadium larwalnym mogą głęboko wpływać na fenotypy obrony immunologicznej w stadium dorosłym.
- Zebrać eksperymentalne muchy 0 - 3 dni po eklozji z puszki poczwarki i przenieść je na świeże podłoże.
- Zebrane muchy należy przechowywać w żądanej temperaturze (zazwyczaj odpowiednie są temperatury od 22 °C do 28 °C) do osiągnięcia wieku 5 - 7 dni po ekluzji.
nuta: Daje to muchom wystarczająco dużo czasu na zakończenie metamorfozy i osiągnięcie dojrzałych osobników dorosłych, ale jest to na długo przed rozpoczęciem starzenia.
- Przed zakażeniem należy posortować żądaną liczbę much do osobnej fiolki, ponownie uważając, aby uniknąć przepełnienia.
nuta: W tej demonstracji zarażane są tylko samce, ale równie możliwe jest zarażenie samic przy użyciu opisanej procedury.
2. Hodowla i przygotowanie bakterii
- Przygotuj płytkę wzorcową z wybranymi bakteriami co najmniej 2 dni przed zakażeniem. Usunąć bakterie z 15% glicerolu przechowywanego przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C. Płytkę wzorcową należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Płytki główne należy zawsze nakładać bezpośrednio z zamrożonego wywaru glicerynowego. Należy unikać seryjnego przechodzenia bakterii z płytki na płytkę, ponieważ powtarzające się przechodzenie w kulturze może spowodować ewolucję bakterii w osłabionej zjadliwości.
nuta: W tym przykładzie wykorzystano Providencia rettgeri i Escherichia coli.
- Należy postępować zgodnie z poniższą procedurą, aby przygotować zawiesinę bakteryjną do wstrzykiwań.
- Wyhodować 2 ml kultury bakterii, zaszczepiając sterylne podłoże pojedynczą kolonią wyizolowaną z płytki wzorcowej. Wyhodować bakterie do fazy stacjonarnej (np. wzrost O/N w temperaturze 37 °C).
nuta: Zarówno P. retggeri, jak i E. coli dobrze rosną w bulionie Luria w temperaturach od 20 do 37 °C z delikatnym wstrząsaniem.
- Gdy hodowla osiągnie fazę stacjonarną, delikatnie osadzać komórki z ok. 600 μl kultury w wirówce stołowej (3 min przy 5 000 x g), odrzucać supernatant i ponownie zawiesić bakterie w ok. 1 000 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Rozcieńczyć zawieszone komórki w sterylnym PBS w celu uzyskania gęstości optycznej (OD) odpowiedniej dla używanej bakterii, mierzonej za pomocą spektrofotometru jako absorbancji przy 600 nm. Użyj tej zawiesiny, aby zarazić muchy.
nuta: A600 = 0,1 lub 1,0 odpowiada odpowiednio około 10,8 i 109 Providencia rettgeri lub E. coli na ml. Ponieważ zarówno żywe, jak i martwe bakterie przyczyniają się do gęstości optycznej, ważne jest, aby zbierać kultury na wczesnym etapie stacjonarnym, zanim zwłoki bakteryjne zgromadzą się i zniekształcą związek między gęstością optyczną a liczbą żywych bakterii wprowadzonych podczas infekcji.
3. Zainfekuj muchy
UWAGA: Ponieważ na odporność Drosophila wpływa rytm okołodobowy, ważne jest, aby przeprowadzać infekcje o podobnej porze dnia w eksperymentalnych powtórzeniach.
- Z septycznym ukłuciem
- Przygotować igłę do nakłucia.
- Stopić końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 200 μl i włożyć szpilkę do pomiaru owadów o średnicy 0,15 mm w stopiony plastik. Poczekaj, aż plastik zestali się tak, aby kołek był utrzymywany na miejscu, tak aby około 0.5 cm kołka wystawało z plastiku.
- Generuj kontrolki zranień.
- Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem CO2 .
- Nakłuj igłą muchy w płytce mostkowo-opłucnej klatki piersiowej, unikając miejsc przyczepu skrzydeł i nóg. W razie potrzeby delikatnie usuń muchy z szpilki za pomocą miękkich kleszczy.
nuta: Możliwe jest również nakłucie much w innych miejscach, takich jak przedni brzuch na powierzchni brzuszno-bocznej, ale ważne jest, aby miejsce wstrzyknięcia było spójne w każdym eksperymencie. Nakłuwanie przez naskórek brzucha jest zwykle trudniejsze niż nakłuwanie klatki piersiowej i dlatego jest mniej powszechne.
- Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nową pożywką na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.
- Wprowadź infekcję bakteryjną.
- Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem CO2 .
- Nakłuć każdą muchę w tym samym miejscu, w którym znajdują się kontrole pożywki, zanurzając końcówkę szpilki w zawiesinie bakteryjnej przygotowanej w procedurze 2.2 przed nakłuciem każdej muchy.
- Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nową pożywką na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.