Pomiar obciążenia bakteryjnego E. coli u Drosophila melanogaster po zakażeniu E. coli

Streszczenie

Źródło: Khalil, S., et al. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru obciążenia bakteriami E. coli po wstrzyknięciu E. coli do klatki piersiowej Drosophila melanogaster.

Protokół

1. Test obciążenia bakteryjnego po infekcji

1. Zmierz obciążenie bakteryjne.
   1. O wyznaczonej porze po wstrzyknięciu umieścić każdą muchę w probówce do mikrowirówki na lodzie.
   2. Dodać 250 μl PBS do każdej probówki i homogenizować muchy za pomocą tłuczka lub trzepaczki do kulek.
   3. Umieścić homogenat na płytce agarowej LB, używając spiralnego płytki lub seryjnego rozcieńczania.
      1. Na płytkę przy użyciu rozcieńczenia seryjnego, przenieść homogenat każdej muchy do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej.
      2. Wypełnić każdą studzienkę w pozostałych rzędach 90 μl PBS.
      3. Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 10 μl z pierwszego rzędu zawierającego homogenat muchowy i dozować do drugiego rzędu.
      4. Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać, a następnie pobrać 10 μl i przenieść do trzeciego rzędu. Powtórz tę procedurę, używając pozostałych wierszy.
      5. Zaczynając od dolnego rzędu (zawiesina większości rozcieńczonych bakterii), za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 10 μl z każdej studzienki i umieścić ją na płytce LB, uważając, aby próbki były dozowane jako dyskretne miejsca, które nie stykają się ze sobą. Powtarzać tę czynność, aż zostaną pobrane próbki ze wszystkich studzienek z każdego rzędu, dozując je w malejącej kolejności rozcieńczenia na płytce LB.
      6. Pozostaw płytkę w pozycji RT, aż plamki całkowicie wsiąkną w płytkę LB.
         nuta: Zaleca się suszenie płytki LB przez kilka dni w temperaturze pokojowej przed użyciem, aby zapewnić łatwe wchłanianie cieczy, minimalizując ryzyko przypadkowego kontaktu między miejscami próbki.
   4. Inkubuj płytki O/N, uważając, aby nie przerosły płytek, aby kolonie pozostały małe i dyskretne.
      nuta: W zależności od zastosowanej pożywki do wzrostu bakterii i temperatury inkubacji, na płytce mogą w końcu pojawić się kolonie pochodzące z endogennej mikroflory jelitowej muchy. Jednak większość bakterii wykorzystywanych do infekcji patogennych rośnie znacznie szybciej niż mikrobiota jelitowa na agarze LB w temperaturze 37 °C.
   5. Wyjąć płytki z inkubatora, gdy eksperymentalne bakterie wytworzą widoczne kolonie (zwykle 8-12 godzin), ale przed pojawieniem się kolonii mikrobioty jelitowej Drosophila (około 36 godzin). W przypadku wolno rosnących bakterii eksperymentalnych należy zastosować selektywny antybiotyk w agarze LB, aby usunąć wszelkie kolonie z mikrobioty jelitowej.
   6. Policz liczbę kolonii dla każdego homogenatu.
      1. W przypadku płytek spiralnych należy policzyć kolonie, które rosną za pomocą automatycznego licznika kolonii, który może oszacować obciążenie bakteryjne na ml homogenatu na podstawie liczby i położenia kolonii na płytce.
         UWAGA: Zliczanie spiralne jest najdokładniejsze, gdy stężenie bakterii mieści się w zakresie 5 x 10² do 5 x 10⁴ bakterii na ml.
      2. W przypadku płytek punktowych należy ręcznie policzyć kolonie dla każdej muchy z dowolnego rozcieńczenia zawierającego 30 - 300 kolonii i obliczyć liczbę bakterii na ml oryginalnego homogenatu.
2. Przeanalizuj dane.
   1. Jeśli obciążenie bakteryjne jest nienormalne, przekształć dane, aby lepiej przybliżyć rozkład normalny lub przeanalizować dane za pomocą nieparametrycznej analizy statystycznej (np. Test U Manna-Whitneya). Użyj analizy Boxa-Coxa, aby znaleźć optymalną transformację; Transformacje logarytmu naturalnego lub logarytmu o podstawie -10 są często skuteczne.
   2. Jeśli dane mają wystarczająco normalny rozkład i kontrastowane są tylko dwa zabiegi, należy wykonać test t, aby określić, czy te dwa zabiegi skutkują różnymi średnimi obciążeniami bakteryjnymi. Jeśli istnieje wiele zmiennych eksperymentalnych lub innych potencjalnie predykcyjnych czynników, użyj analizy wariancji (ANOVA), aby określić, które czynniki są istotnymi predyktorami obciążenia bakteryjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szalki Petriego z przezroczystymi pokrywkami, podniesiony grzbiet; 100 x 15 mm;	VWR Polska	Nr kat. 25384-302
LB Agar, Młynarz	Firma Difco	Numer katalogowy: 244520
Pętla zaszczepiająca	VWR Polska	80094-488
1,5 ml probówki do mikrowirówek; Rytuał pieczęci	USA Scientific Inc.	1615-5500
zmotoryzowany tłuczek; Mieszadło laboratoryjne Talboys	Troemner	Rozdział 103
Homogenizator wysokoprzepustowy Talboys	Diagnostyka OPS	930145
Kule szlifierskie 5/32''	Diagnostyka OPS	Jednostka GBSS 156-5000-01
Dżin Vortex	Przemysł naukowy inc.	Telefon G560
Pipetor wielokanałowy (10uL-300uL)	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer telefonu 730360
WASP2 Whitley Zautomatyzowany plater	Mikrobiologia Międzynarodowa
Automatyczny licznik kolonii ProtoCOL / licznik płytek / czytnik płytek	Mikrobiologia Międzynarodowa
inkubator	Powers Scientific, Inc	DROS52SD